APOPTOSIS – SỰ CHẾT CỦA TẾ BÀO


APOPTOSIS – SỰ CHẾT CỦA TẾ BÀO

Phùng Trung Hùng – Phạm Thiên Tánh – Nguyễn Phước Long

image

Tóm tắt

Sự tăng sinh và chết tế bào là hai mặt của một vấn đề giúp đảm bảo cân bằng nội môi tế bào. Những mạng lưới điều hoà điều khiển đời sống và quyết định cái chết trên cấp độ tế bào thì phức tạp hơn nhiều so với chúng ta từng nghĩ. Quá trình này diễn ra bình thường là nhờ vào sự diều hòa một các nghiêm ngặt của cơ thể nhưng khi gặp một số tác nhân tạo nên sự mất cân bằng (như bệnh, thoái hóa neuron,biến đổi tạo hình), quá trình này sẽ thay đổi. Apoptosis có ở tất cả các động vật đa bào. Điều quan trọng ở đây là các tế bào nào sẽ tham gia vào quá trình chết tế bào apoptosis và cách các tế bào này vào apoptosis.

Hai con đường chính dẫn đến quá trình apoptosis: các thụ thể chết (lộ trình bên ngoài) vàlộ trình ty thể (lộ trình bên trong). Lộ trình ty thể là một quá trình nhanh chóng và mạnh mẽ. Sự phá huỷ ty thể làm phóng thích các yếu tố tiền apoptosis như cytochrome c. Còn nhiều lý do làm cho quá trình nghiên cứu gặp khó khăn, một trong số đó là cho đến nay người ta vẫn chưa chắc chắn về mối quan hệ của hai lớp màng của ti thể và mối quan hệ của các lỗ lớn tham gia. Gần đây, nghiên cứu trênsự tái cấu trúc mào ty thể đã cho ta biết về một “trạm kiểm soát” các tế bào đi vào apoptosis, qua đó xác định độ nhạy của con vật trưởng thành với apoptosis.

Giới thiệu: Sự sống và cái chết

Sự sống và cái chết đi chung với nhau như 2 mặt của cùng một đồng xu. Sinh học tế bào và sinh hoá đã củng cố cho luận điểm này, cho chúng ta thấy rằng đã có sự sống ăt hẳng sẽ phải có cái chết và ngược lại. Các tế bào có thể chết vì già, vì khiếm khuyết, vì thừa so vơi nhu cầu của mô hay vì chúng gây ra vài hư hại. Điều chắc chắn là tất cả tế bào thật sự được lập trình để chết. Nhưng các tế bào sống được là nhờ một loạt những tín hiệu ngăn cản chúng thực hiện các chương trình chết của mình. Kết quả là, các tế bào sống sót, tăng sinh, biệt hoá, và thực hiện những chức năng của chúng. Các tín hiệu ngăn cản chương trình chết này có thể là các tín hiệu nội bào hay ngoại bào. Khi các tín hiệu này không được phát ra hay có một tín hiệu khác mạnh hơn nó được hoạt hóa, tế bào sẽ đi vào chu trình chết của chúng. Trong trường hợp này, sự sống là bất cứ điều gì mà không có cái chết.

Điều này dẫn đến việc tế bào sinh ra rồi lại chết đi và có chết đi mới có tế bào tiếp tục được sinh trưởng và phát triển, cứ tiếp tục như thế cho đến hết cuộc đời hay nói khác hơn chết có chu trình đóng một vai trò chủ chốt trong việc phát triển và tăng trưởng của những sinh vật phức tạp. Một lượng lớn các tế bào chết trong quá trình phát triển của phôi, ví dụ trong giai đoạn tạo tác hình thành các cơ quan. Trong cuộc đời của các sinh vật trưởng thành, các tế bào chết đi với một số lượng lớn đối trọng với sự phân chia tế bào để (1) cung cấp cho cơ thể những tế bào cần cho những giai đoạn khác nhau, (2) để diệt những tế bào già, hư hại hoặc gây hại trong tổng số tế bào hằng định nội môi. Sự mất cân bằng giữa sự phân chia tế bào và sự chết tế bào dẫn đến những bất thường về phát triển, những bệnh thoái hoá hay những biến đổi tân sinh.

Những cách thức tế bào chết đi

Sự hoại tử

Tác nhân gây bệnh là chấn thương nghiêm trọng như: bỏng, đứt hay đènén, có thể gây chết tế bào hoại tử.Trong cái chết hoại tử này, tình trạng stress quá mức gây nên tình trạng sinh hóa không tương thích với sự tồn tại bình thường của tế bào. Trong trường hợp này, những khối các tế bào trong mô bị sưng phù và sau khi nghiên cứu người ta nhận thấy rằng các khối tế bào bào này không còn tồn tại hoạt động chuyển hóa. DNA nhân ngưng tụ, tập trung nhiều nhất ở rìa nhân và các thành phần tế bào bắt đầu phân hủynhanh chóng và không kiểm soát được. Những chất quan trọng nội bào nhanh chóngrò rỉ ra khỏi tế bào, kích hoạt tình trạng viêm nhờ tế bào của hệ miễn dịchbẩm sinh.Những bằng chứng gần đây cho thấy rằng đáp ứng viêm được khởi phát bằng cách phóng thích một phổ đầy đủ của các phân tử được gọi chunglà alarmins, mà cụ thể danh tínhvẫn còn chưa được xác định chính xác. Đặc điểm chung của chúng là khả năng hoạt hóa các thụ thể nhận dạng đại thực bào, tế bào đuôi gai và các tế bào diệt tự nhiên. Qua đo các alarmins này sẽ giúp các tế bào của hệ miễn dịch kích hoạt được tế bào T và bắt đầu đáp ứng miễn dịch, để ngăn chặn nhiễm trùng và loại bỏ tế bào ở các mô đang bị viêm.Tại thời điểm này, các mảnh vỡ tế bào bị nhấn chìm và được loại bỏ bởi các đại thực bào.

image

Hình 46.1: Sự khác biệt giữa hoại tử và apoptosis. Nét cơ bản là sự phá hủy màng bào tương phóng thích tất cả thành phần của tế bào ở hoại tử, điều này có thể khởi phát tiến trình viêm lan rộng. Trong apoptosis, màng bào tương nguyên vẹn của các thể apoptotic hầu như sẽ bị thực bào êm đềm không khởi phát tiến trình viêm.

Apoptosis

Quá trình thứ hai của cái chết được đặt ra là apoptosis (trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là sự rụng lácây cối). Năm 1972, một kiểuchết tế bào mới được định nghĩa đã được xác định bởi Kerr, Wyllie, và Currie.Ban đầu kiểu chết này được xem như không thoái hóa trong tự nhiên nhưng sau đó một bài nghiên cứu ấn tượngsau đó đã chứng minh điều ngược lại. Apoptosis là khôngchỉ là một quá trình hoạt động theo thứ tự, mà nó còn là một quá trình yên lặng bằng cách tháo dỡ các tế bào nhưng không lan truyền bừa bãiđến các tế bào xung quanh. Ở cấp độ tế bào, quá trình này đặc trưng bởi một sự khởi phát làm thủng các tế bào và sau đóphá vỡ những mối liên hệ tế bào-tế bào. Các tế bào co tròn lại và màng nội bào và các bào quan cô đặc lại nhiều hơn trong tế bào chất, sau đó chúng sẽ tối hơn.

image

Hình 46.2: tiến trình Apoptosis.

Đáng chú ý là ở thời kì muộn của quá trình, các bào quan vẫn còn nguyên vẹn và bình thường,cho thấy hoạt động chuyển hóa vẫn còn quan trọng đối với tế bào trong thời gian đầu. Các thành phần tế bào chất không bị rò rỉ khỏi tế bào, vì vậy, đáp ứngviêmkhông được tạo ra. Trong nhân, chất nhiễm sắc cô đặc tối đa và thườngtạo ra các phần hình lưỡi liềm bao quanh màng nhân hoặc pycnosis. Sự kiện rất đặc biệt nàykhông nhìn thấy trong bất kỳ trường hợp nào khác.Endonucleasestách một cách chính xác DNA giữa các nucleosome, cho ra những mảnh vỡ của 180 (hay nhiều hơn) đôi base. Mặc dù ít được chú ý hơn, những mạng lưới nội bào khác như Golgi, lưới nội chất và ty thể cũng bịphân mảnh đáng kể. Trong khi quá trìnhphân cắt DNA tiếp tục, nhân bắt đầu vỡ thành từng mảnh vàtế bào tương tự cũng chia tách thành một số mảnh nhỏ còn nguyên vẹn hoặc các thể apoptosis không bắt màu thuốc nhuộm. Sau đó xảy rasự thực bào, một quá trình trong đó các đại thực bào di cư hay các tế bào biểu mô khoẻ mạnh xung quanh nuốt các mảnh vỡ của tế bào. Sự kiện này đặc biệt đáng chú ý là ở trạng thái bình thường các thực bào nàytham gia trong việc nhận và loại bỏ vật lạ hoặc các thực thể “không phải của bản thân”. Kết quả là, các thể apoptosis gắn vào một túi được bao bọcbởi màng trong một tế bào gọi là thể thực bào. Cuối cùng, tế bào chủhay thể thực bào và chất chứa của nó dần dần bị suy thoái, và trong nhiều trường hợp, một tế bào mới thay thế tế bào cũ trong một vài giờ. Trong một số hệ thống tế bào,đặc biệt là trong nuôi cấy tế bào (in vitro), apoptosis không xảy ra với đầy đủ các bước và theo đúng trình tự thời gian như ở trên.Lưu ý, sự cô đặc nhiễm sắc chất thành quả bóng đặc hình cầu tại một đầu của nhân không phải là bất thường. Trái lại, khi nuôi cấy trong ống nghiệm (in vitro), các tế bào trải qua quá trình apoptosis bị mất một phần màng plasma. Trong trường hợp không có đại thực bào, các tín hiệu apoptosis có vai trò thúc đẩysự tự loại bỏ nhanh chóng bởi sự vắng mặt các đại thực bào nhận diện sự bất thường (ví dụ như sự ngoại bào hoá phosphatidylserine từ lớp trong ra lớp ngoài trên màng bào tương của chúng) không thể xảy ra. In vivo, sự nhận diện này loại bỏ hiện tương viêm và khở động phản ứng đông máu.

image

Hình 46.3: Scramblase hoán vị phosphatidyl serine từ lớp lipid trong ra lớp lipid ngoài, macrophage có thể nhận diện sự bất thường này, ngoài ra PS còn có thể tương tác với Annexin V (AV) và là vị trí gắn kết với phức hợp prothrombinase factor Xa,Va &II(ngăn chận tiến trình đông máu in vivo).

image

Hình 46.4: gắn kết phosphatidyl serine-AnnexinV.

image

Hình 46.5: gắn kết Annexin V (A5)-PS vị trí nhận diện của macrophage.

Sự tự thực (Autophagy)

Bên cạnhsự hoại tử và apoptosis, chúng ta nên giới thiệu một quá trình đáng chú ý thứ ba quyết định cái chết của tế bào và có vai trò ngày càng quan trọng trong cuộc sống con người. Đó là sự tự thực. Nếu như apoptosis là rất quan trọng trong phát triển và sinh lý bình thường cũng như trong một phạm vi rộngcác bệnh lý thìsự tự thực cũng vậy. Sự tự thực hay chính xác hơn là đại tự thực, là một quá trình ly giải proteinliên quan đến cô lập các bộ phận của tế bào chất trong những túi màng đôiđược gọi là túi tự thực hoặc các autophagosomes, kết hợp với các lysosomes hình thành nên autophagolysosome.Trong autophagosome, vật chất trong tế bào chất bị nuốtbị thủy phân và các sản phẩmamino acids, các tiền chất đại phân tử kháccó thể được tái chế. Sự tự thực hạn chế này là một cơ chếđể cung cấp cho các tế bào các cơ chất trao chuyển hoá để đáp ứng nhu cầu năng lượng của mình dưới những điều kiện căng thẳng, chẳng hạn như: sự tước mất chất dinh dưỡng. Đây cũng là cơ chếly giải proteincăn bảncho nhữngprotein bị mòn và ủng hộ việc loại bỏ có chọn lọc các bào quan bị hư hỏng (và có thể nguy hiểm), nhờ đó duy trì kiểm soát chất lượng của chúng. Trongnhững trường hợp này, sự tự thực hoạt động như một cơ chế tiền sống sót. Mặc dù người ta đã mô tả rằngsự tự thực có thể bảo vệ các tế bào bằng cách ngăn chặn chúng trải qua quá trình apoptosis, mọi thứ không đơn giản như vậy, vàvai trò của nó hiện còn đang bàn cãi, vì nó cũng có thể làm ngược lại tức là nó có thể giết chếtcác tế bào. Trong thực tế, chết tế bào do tự thực còn được gọi là chết tế bào được lập trình loạiII để phân biệt với quá trình apoptosis hoặc chết tế bào được lập trìnhloại I. Gọi như vậy vì các tế bào có khiếm khuyết trong bộ máy apoptosis sẽ chết theo kiểu tự thực.Ngoài ra, chết tế bào do tự thực có thể được gây ra bởi sự tăng các oxygen dạng tái hoạt động cũng còn gọi là gốc oxy tự do phản ứng (reactive oxygen species, ROS), kết quả của sự ly giải proteintự thực của catalase. Ở các tế bào chết do apoptosis, các protein cấu trúc như bộ khung tê bào sẽ bị ly giải protein sớm trong khi các bào quan được giữ nguyên đến cuối quá trình. Ngược lại, trong chết tế bào do tự thực, một sự tích lũy lớn các túi tự thực liên quan đến sự ly giải protein đầu tiên của các bào quan, trong khibộ khung tế bào vẫn còn nguyên vẹn và duy trì chức năng cho đến khi vào cuốiquá trình. Bất kể những điểm khác biệt về hình thái đáng kể giữa apoptosis và sự tự thực, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy sự đại tự thực có mối quan hệ phức tạp với quá trình apoptosis dựa trên các kết nối chặt chẽ tồn tạigiữa các tác nhân kích thích và bộ máy điều hoà kiểm soát cả hai quá trình này. Đó lànhững chất điều hoàsự tự thực có thể kiểm soát quá trình apoptosis và ngược lại. Vì vậy, mặc dù các nghiên cứu về hình tháisẽ dẫn chúng ta đến kết luận rằng quá trình apoptosis và đại tự thực là hai cách chết khác nhau nhưng có lẽchúng chỉ là hai khía cạnh khác nhau của cùng cơ chế chết tế bàotích hợp. Hơn nữa, nhiều ví dụ bắt đầu chỉ ra rằng thật sự không có hai cơ chế chết tế bào được lập trình (apoptosisvà sự tự thực) và một cơ chế ítđược điều hoà thứ ba (hoại tử). Thay vào đó, chết tế bào có thể được coi là một cơ chế tích hợp trong đó ba quá trình làm việc với nhau và điều hoà lẫn nhau một cách liên tục, với sự phân biệt không rõ ràng giữa chúng. Các tế bào đã đi vào quá trình chết thì nếu không chết bằng apoptosis thì cũng sẽ chết bằng con đường khác. Chúng ta chỉ nghiên cứu cơ chế chết nổi bật nhất tại 1 thời điểm trong tế bào. Tuy nhiên, có sự phân biệt rõ ràng giữacái chết được cam kếttứcapoptosis và sự tự thực, chúng ta có thể khẳng định rằng trong khi cái chếtdo xâm phạm (sự tự thực) là một sự hỗn loạn và là một quá trình thụ động, cái chết đã cam kết (apoptosis) là một quá trình có thứ tự, được lập trình, và hiện diện trong tất cả các quá trình hoạt động ở cấp độ phân tử.

Số phận của tế bào và Apoptosis

Rất rõ ràng rằng các tế bào khỏe mạnh và các tế bào đã được tiếp xúc với một tác nhân gây hư hạicó các chương trình di truyền và phân tử để nhận được hướng dẫn (tín hiệu) và đáp ứng với những tín hiệu này. Đáp ứng này có thể là một chuỗi các sự kiện dẫn đến việc đình chỉ chu kỳ tế bào và sửa chữa hoặc lựa chọn đi đến apoptosis. Tế bào có thể bị xâm phạm bởinhững chất độc và không độc đối vớibộ gene làm tăng nhanh chóngp53. Thật ra tất cả các loại gây hại đến DNA (ví dụ: bức xạ, phản ứng với các gốc tự dooxy hóa, thuốc, nhiễm virus, v.v) được xác định là do sự tồn tại của protein p53 và lộ trình chuyển hoá của nó. Ngoài ra hư tổn các thành phần liên quan đến việc phân bố các vật liệu di truyền (chẳng hạn như thoi phân bào), tình trạng thiếu oxy, sự kích hoạt oncogen,cạn kiệt ribonucleotide hoặc tiếp xúc với nitric oxide, cũng gia tăng mức đáng kể nồng độ của protein này trong tế bào. Do đó, lộ trình p53liên quan đến hàng trăm gen và các sản phẩm của chúng đáp ứng một loạt cáctín hiệu stress tế bào và p53 được xem là protein được nghiên cứu nhiều nhất hiện nay. Nóđóng vai trò quan trọng trong việc theo dõi tính chính xác trong di truyền của tế bào, vì vậy mà nó còn được gọi là “chấtbảo vệ bộ gen “. p53 đáp ứng với sự hư hại DNA hay với việc các tế bào không vượt qua được check-point bằng cách tạo một loạt phản ứng chống tăng sinh. Các nghiên cứuvề khiếm khuyết di truyền khi cấy ghép sớm trước và sau phôi động vật có vú đã chứng minh rằng được rằng p53 sẽ làm các tế bào quái thai chết đi thông qua apoptosis và làm sẩy nhưng phôi bị khiếm khuyết. Như vậy, một trong những chức năng quan trọng nhất của p53 là khả năng tạo ra apoptosis, sự gián đoạn của lộ trình p53 này có thể thúc đẩy sự tiến triển của khối u và sức đề kháng hóa trị. Các chương trình dịch mã của p53 rất linh hoạt, vì nó thay đổi theo bản chất của các kích thích kích hoạt, loại tế bào và thời gian của tín hiệu kích hoạt. Tính linh hoạt này có thể cho phép tế bào gắn kết các phản ứng thay thế để kích hoạt p53, chẳng hạn như ngừng chu kỳ tế bào hoặc apoptosis. Làm thế nào p53 có liên quan trong việc đưa ra quyết định này vẫn chưa được biết rõ. Dù vậy đối với một tế bào riêng lẻ, sự lựa chọn có thể được chi phối bởi mức độ mà lượng p53 được nâng lên đáp ứng với sự hư hại DNA.Với lượng thấp p53thì khởi động gen sửa chữa, còn lượng p53 cao hơn được yêu cầu để mở những genes apoptosis hoặc tắt những genes dành cho sự sống còn. Bên cạnh khả năng thúc đẩy apoptosis thông qua cơ chế dịch mã phụ thuộc, p53 cũng có thể kích hoạt apoptosis độc lập với sư điều hoà dịch mã.

Để đảm bảo sự phát triển của tế bào bình thường, nồng độ và hoạt động của p53 được điều hoà một cách chặt chẽ. Trong hầu hết các tế bào ở điều kiện bình thường, p53 thường hiện diện ở mức rất thấp hoặc không thể phát hiệnđược. Protein này có một cuộc sống rất ngắn (6-30 phút) và nồng độ của nó phần lớn được quy định bởi sựphân huỷ protein nhanh chóng. Nhờ các hình thức đa dạng của stresstế bào,mức độ ổn định và hoạt động phiên mã củap53 xảy ra nhanh chóng (trong vòng hai giờ). Sự ổn địnhvà kích hoạt p53 là một kết quả của sự ức chế bị cản trở bởi các chất điều hoà âm như Mdmx (còn được gọi là Mdm4) và Mdm2; trong khi các chất kích hoạt khác như HIPK2 và DYRK2 có thể tăng cường đáp ứng p53. Khi p53 được tăng lên và kích hoạt, nó sẽ tăng khả năng liên kết với các yếu tố chuỗi DNAđáp ứng p53 trong hệ gene tạo nên sự thay đổi trong sao chép ở hơn 150 genesđược điều hoà dương hay âm bởi p53. Một vài gene điều hòa bởi p53 có thể được sao chép khi nhận được nhiều loại tín hiệu khác nhau và xảy ở tất cả các mô (ví dụ như MDM-2, Gadd-45, hoặc những genes mã hóa cho p21 và cyclin G)nhưng cũng có một vài gene chỉ sao chép khi nhận được tín hiệu phù hợp ở những mô phù hợp mà thôi (ví dụ như PTE TSC-2).Cơ chế của quá trình điều hòasự khác biệt này vẫn chưa rõ ràng.Chức năng của các gen đáp ứng với p53 gồm nhiều loại. Một tập hợp các genvà các sản phẩm của chúngliên quan đến việc đình chỉ chu kỳ tế bào và quá trình lão hóa tế bào(ví dụ như p21, 14-3-3 sigma, Gadd-45). Trong các tế bào không thể sửa chữa, một bộ thứ hai cácgenesdo p53điều hoàsẽ tham gia vào quá trình apoptosis. Như chúng ta sẽ thảo luận dưới đây,cả lộ trìnhbên trong và bên ngoàicủa quá trình apoptosis đều được khởi phát.Tronglộ trìnhbên ngoài,p53điều hoà sản xuất Fas (một protein được tiết ra), cũng nhưDR5/killer, thụ thể trail và một protein màng. Lộ trình tín hiệu nội tại được tăng cườngvới nhiềugenes do p53 điều hoà trong đó các protein Bax, Noxa vàPuma có thể hoạt động trong các loại tế bào khác nhau. Mối quan tâm chính của các nhà nghiên cứu bây giờlà cách p53 khởi sự apoptosis thông quachương trình dịch mã của nó một cách chi tiết và cụ thể.Mặc dù có rất nhiều tế bào được tạo thành trong suốt quá trình cảm ứng của apoptosis nhưng chưa xác định được một gen đích mà sự thay đổi biểu hiện đơn lẻ của nó có thể giải thích đầy đủ quá trình p53. Người ta đã chứng minh rằng một phần nhỏp53 sinh ra nhanh chóng di chuyển ra khỏi nhân và thúc đẩy apoptosis trong khi nó tương tác với các thành phần chống và tiền apoptosis của của dòng tế bào B CLL/lymphomacủa những chất điều hoà hoà tính thấm ty thể. Một số nhóm nghiên cứu đã xác nhận sự tồn tại của cái chết ty thể trực tiếp qua trung gian p53.

image

 

Hình 46.6: tích hợp lộ trình tín hiệu của hiện tượng Apoptosis. Lưu ý vai trò của protein14-3-3 và p53. protein 14-3-3 chịu tác động sớm từ Akt(protein kinase B) ức chế hoạt động của Bad và FoxO1 kiểm soát chu kỳ tế bào và apoptosis. p53 có tác động hai mặt, sửa chữa sai lệch ở đoạn DNA ngắn; khi không thể sửa chữa thì protein này có vai trò biểu hiện gen apoptosis gây chết tế bào.

 

Sự huỷ diệt của tế bào và sự kết thúc của Apoptosis 

Một khi quá trình apoptosis được kích hoạt,giai đoạntác động của sự hủy diệt của tế bào trong hầu hết trường hợplà con đường không thoái lui. Những biến đổi hình thái biểu hiện của apoptosis được tạo ra bởi những gì diễn ra trong giai đoạn này, và sự gián đoạn của nó chỉ đơn thuần là không điều hoà quá trình đó chứ không cho các tế bào sống sót. Nghiên cứu tiến hành trong hai thập kỷ qua đã cho ta biết về một mạng lưới phức tạp các phân tử thực hiện và điều tiết quá trình apoptosis. Điều thú vị là, trong những năm gần đây, một sự chuyển đổi mô hình đã xảy ra và nó giúp chúng ta hiểu rằng các protein tham gia vào quá trình apoptosis cũng thực hiện những chức năng không liên quan đến chết tế bào. Thật vậy, có vẻ như sự tiến hóa đã không “tạo” ra những yếu tố tiền apoptosis mà đúng hơn là đã “chiếm đoạt” những phân tử đã có chức năng trong các quá trình quan trọng (chẳng hạn như thích ứng với stress) vào chết tế bào theo chương trình.
Ở cấp độ proteome, hầu hết các tính năng siêu cấu trúc của quá trình apoptosis là kết quả của hàng trăm protein trải qua quá trình ly giải protein bị hạn chế trong giai đoạn tác động. Tuy nhiên, cho đến nay sự liên quan của đa số các sự kiện ly giải protein vẫn còn chưa rõ ràng. Một loạt các protease cystein từ họcaspase làm trung gian phân cắtnhiều protein này. Trong thực tế, gần như tất cả các kích thích kích hoạt apoptosis đều thông qua việckhởi phátcác sự kiện liên quan đến kích hoạt caspase, mặc dù theo những cách hơi khác nhau. Trong các động vật có vú, ba cách chính để kích hoạt caspase apoptosis liên quan đã được công bố, bao gồm (1) con đường ngoại sinh hay con đường thông qua thụ thể chết, (2) con đường nội sinh hay con đường qua trung gian ty thể và (3)con đường B granzyme. Ngoài ra, ít nhất là hai con đường khác đã được đề xuất nhưng chúng vẫn chưa biết rõ.

Lộ trình ngoại sinh

Lộ trìnhngoại sinh được khởi độngbởi các kích thích ngoại bào, chẳng hạn như phóng thích các yếu tố tăng trưởng kích động sự gắn của các thụ thể chết xuyên màng (một tập hợp con họthụ thể TNF, bao gồm cả TNFR1, Fas/CD95, thụ thể TRAIL -1 và -2, và cả thụ thể chết3) với các ligand cùng nguồn gốc với chúng. Điều này làm hoạt hoá trực tiếp các thụ thể này thông qua trimerization và của một phức hợp tín hiệu gây chết (death-inducing signaling complex – DISC) lớn ở mặt tế bào chất của màng bào tương. Mặc dù các thành phần của DISC chưa được xác định, người ta thấy rằng vùng Fasliên quan đến cái chết (Fas-associated death domain, FADD)dường như là thành phần bắt buộc, tuyển chọn và điều biến sự kích hoạt tự động caspase khởi phát, tiền caspase 8 (và có thể của caspase 10).  Caspase 8 hoạt động sau đó ly giải protein bằng cách cắt đứt và kích hoạt caspase3, 6 và 7; dẫn đến các việc kích hoạt thêm caspase cho đến khi đến đỉnh trong quá trình ly giải protein chất nền và chết tế bào. Con đường ngoại sinh có thể được kích hoạt bằng các thụ thể phụ thuộc, chúng cung cấp một tín hiệu cái chết khi không có các ligands của chúng, thông qua các chất trung gian chưa được biết đến.

Trong trường hợp không ligand, các thụ thể này kích hoạt chết tế bào, do đó tạo ra một tình trạng các ligand phụ thuộc tế bào. Nguyên mẫu các thụ thể phụ thuộclà
các thụ thể netrin-1 DCC (bị mất trong ung thư đại trực tràng) và UNC5H-1, -2, -3.

image

Hình 46.7: Sơ đồ lộ trình apoptosis nội sinh và ngoại sinh. Trong lộ trình ngoại sinh, sự tham gia của cácthụ thể chết với các ligands cùng nguồn gốcgây ra việc bổ sungcácproteinschuyển đổi, chẳng hạn như protein FADD- protein tuyển chọn và tổng hợpmột số phân tử caspase 8. Phức hợp tín hiệu gây chết (DISC) do đó hình thành trongmặt tế bào chất của màng bào tương, thúc đẩy quá trình xử lý tự động và kích hoạt tiền caspase 8 (và có thể của caspase 10). Đến phiên nó có thể cắt đứt caspase tác động 3, 6, và7. Caspase 8 cũng có thể ly giải kích hoạt Bid. Bid được cắt ngắn đại diện cho các liên kết chính giữalộ trìnhapoptosis ngoại sinh và nội sinh, bởi vì nó hỗ trợviệc kết hợp và chènBax và Bak vào màng ngoài ty thể. Kết quả là quá trình Apoptosis tạo ra kênh (MAC membrane attack complex bao gồm C6, C7, C8α, C8β, C9và perforin) thúc đẩy tăng tính thấm của màng ty thể, đó là dấu hiệu của lộ trình nội sinh. Trong con đường này, một số tín hiệu nội bào, bao gồm stress tổn hại DNA và lưới nội chất (ER), hội tụ trên ty thểđể làm màng ngoài thấm, gây giải phóng các yếu tố tiền apoptosis từ khoảng gian màng. Trong số này, Cyt c gây ra yếu tố apoptosis hoạt hoá protease – 1(APAF-1) và ATP / dATP để lắp ráp các apoptosome, một phân tử nền tảng thúc đẩy sựtrưởng thành nhờ ly giải protein của caspase 9. Đến lượt caspase 9 hoạt động, cắt đứt và kích hoạt các caspasesphản ứng, cuối cùng dẫn đến kiểu hình apoptosis. Chất kích hoạt thứ hai có nguồn gốc từ ty thể của các caspases/ protein gắn kết IAP (inhibitor of apoptosis protein) trực tiếp với một pI thấp (Smac/DIABLO) và endoprotease được điều hoà bởi Omi stress/ protein A2yêu cầu nhiệt độ cao (Omi/HtrA2), thúc đẩy quá trình apoptosis gián tiếp, bằng các gắn kết với các chất đối vận của họ IAP (chất ức chế protein apoptosis). Lộ trìnhphụ thuộc granzyme B của sự hoạt hoá caspase liên quan đến việc cung cấp các protease này vào tế bào đích thông qua các hạt chuyên biệt được phóng thích từ các tế bào lympho T gây độc tế bào hoặc các tế bào diệt tự nhiên. Những hạt này cũng chứa lỗ hình thành protein perforin, cho phép granzymes đi vào. Granzyme B có thể xử lý Bid cũng như caspase 3 và 7 để bắt đầu quá trình apoptosis.

Lộ trình nội sinh

Lộ trình nội sinh dựa trên tính thấm hoá của màng ty thể (mitochondrial membrane permeabilization, MMP) để giải phóng các yếu tố tiền apoptosis như cytochrome c-apoptosis từ khoảng gian màng của bào quan này. Ví dụ, trong điều kiện của stress tế bào, những chất chống apoptosis trong họ protein Bcl-2 (ví dụ, Bcl-2 và Bcl-XL), cư trú trong màng ty thể bên ngoài, có thể mất ổn định thông qua giảm biểu hiện, hoặc bổ sung các thành viên tiền apoptosis của họ Bcl-2 (ví dụ: Bax, Bad, và Bak). Tỷ lệ giữa các chất tiền apoptosis và chất đối kháng apoptosisngày càng lớn. Việc này gây ra sự lắp ráp các oligomers Bax-Bak ở màng ngoài ty thể. Những oligomers này làm tổn thương tính thấm của màng, cho phép sự thành lập những kênh đầy protein ngoài màng.  Kết quả là những yếu tố tiền apoptosis từ khoảng gian màng của ty thể được phóng thích vào tế bào chất. Trong số này, cytochrome c (Ctyt c) hoạt hoá trực tiếp Apaf-1 và với sự hiện diện của dATP hoặc ATP, tạo điều kiện hình thành một phức hợp multimeric lớn- thể “apoptosome”. Thể apoptosome tuyển lựa và điều biến quá trình tự hoạt hoá caspase khởi đầu, tiền caspase 9, rồi chất này tiếp tục hoạt hoá caspase 3, 6 và 7.

Những chất thuộc họ Bcl-2 không phải là tác nhân duy nhất có khả năng xúc tiến MMP cần để phóng thích những yếu tố tiền apoptosis từ khoảng gian màng của ty thể. Các proteases cũng như các tác nhân khác (ceramide, các ROS và Ca2+) cũng có thể có chức năng này. MMP thậm chí có thể lập trình một tế bào đi vào cái chết khi các caspases không được hoạt hoá. Cái chết không phụ thuộc caspase này có thể xảy ra do sự mất chức năng không hồi phục của ty thể cũng như do ty thể phóng thích các chất tác động cái chết không phụ thuộc caspase bao gồm yếu tố gây ra apoptosis (apoptosis inducing factor-AIF) và endonuclease G. Cả 2 chất này đi từ tế bào chất đến nhân làm phân đoạn DNA và cô đặc nhiễm sắc chất.

Ở mức độ phân tử, sự giao thoa giữa 2 cơ chế apoptosis nội sinh và ngoại sinh xảy ra khi hoạt hoá caspase 3, 6, và 7. Hơn nữa, mục tiêu sinh lý của caspase 8 được hoạt hoá là Bid, một protein BH3- họ hàng duy nhất với Bcl-2, thiếu mất vùng xuyên màng. Ở vài tế bào, để đáp ứng với ligands thụ thể chết, caspase 8 cắt Bid thành phân đoạn tận cùng là carboxy bị cắt ngắn (tBid) đi từ tế bào chất đến màng ngoài ty thể. Những oligomers của tBid có thể khởi phát sự thấm của màng ngoài ty thể, theo sau bởi sự phóng thích những yếu tố tiền apoptosis. Bằng cách này, Bid cũng điều biến sự trao đổi giữa 2 con đường nội sinh và ngoại sinh của apoptosis. Ở mức độ thụ thể chết, sự giao thoa giữa con đường nội sinh và ngoại sinh được nghiên cứu rất nhiều. Trong khi ở một số loại tế bào (tên là loại 1), liên kết của ligands với thụ thể chết hoạt hoá những caspase tác động mà không cần có MMP, ở loại khác (loại 2) dòng thác tín hiệu phức tạp ở trên (hoạt hoá caspase 8 -> cắt đoạn và hoạt hoá Bid -> MMP -> hoạt hoá Caspase 3 pụ thuộc Cyt 2) hoàn toàn phụ thuộc vào MMP.

 

Các lộ trình Granzyme B

image

Hình 46.8: chi tiết lộ trình tín hiệu của nối kết hạt độc chứa granzyme-B &FAS-FASL, cho thấy con đường chung là hoạt hóa caspase 8.

 image

Hình 46.9: tế bào ung thư nối kết với cytotoxic lymphocyte qua 2 loại kết nối TCR (T cell receptor)-MHC I & FAS-FASL có vai trò cô lập một vùng màng bào tương giữa 2 kết nối này. Các hạt độc phóng ra từ cytotoxic lymphocyte hướng tới tế bào ung thư chỉ giới hạn trong khu vực này cách thức giao tiếp tế bào này được gọi là tiếp tiết (juxta crine).Các hạt độc chứa Granzyme, Ca2+C6, C7, C8α, C8β, C9và perforin, granzyme gắn kết với thụ thể mannose-6-phosphate (MPR) và xâm nhập tế bào ung thư. Gắn kết giữa TCR-MHC I cần thiết cho sự hoạt hóa lộ trình PI3K phóng thích Ca2+ từ ER của lymphocyte là động lực xuất bào của hạt độc. P19 là một protein ức chế đặc hiệu granzyme-B có thể ức chế quá trình apoptosis. Những tế bào ung thư tăng biểu hiện FASL có thể gây chết cho cytotoxic lymphocyte qua lộ trình caspase của lymphocyte này, điều này giải thích sự thất bại của lymphocyte trong việc phá hủy tế bào ung thư.

image

Hình 46.10: Perforin & granzyme-B.

Lộ trình phụ thuộc granzyme B của quá trình hoạt hoá caspase liên quan đến sự phân phối protease này vào tế bào đích thông qua các hạt chuyên biệt được phóng thích từ những tế bào lympho T gây độc tế bào (cytotoxic T lymphocytes, CTL) hoặc các tế bào diệt tự nhiên (natural killer, NK). Các hạt CTL và NK chứa rất nhiều granzymes cũng nhưng lỗ tạo thành protein, perforin. Khi tế bào CTL hay NK được hoạt hoá bởi thụ thể kháng nguyên của chúng, các hạt được ly giải di chuyển tụ lại và xếp dọc synapse miễn dịch. Màng của những hạt này hoà với màng bào tương của tế bào diệt và giải phóng các chất có trong nó vào sypnase bao gồm perforin và granzymes. Granzymes gắn kết bới màng tế bào đích bởi liên kết tĩnh điện (granzymes được tích điện dương với pI khoảng 9-11, và bề mặt tế bào thì tích điện âm), và bởi những thụ thể chuyên biệt như thụ thể không phụ thuộc cation mannose-6-phosphate. Tuy nhiên, những thụ thể chuyên biệt này không phải là cửa ngõ duy nhất cần thiết cho sự gắn kết và gây độc tế bào. Ngõ vào của granzymes vào trong tế bào chất của tế bào đích được điều biến bởi perforin, nhưng cách thức hoạt động của perforin thì chưa được rõ. Mô hình đầu tiên về ngõ vào của granzyme thông qua những lỗ trên màng bào tương tạo ra chính bởi perforin được xem là có giá trị. Một mô hình sửa đổi công nhận rằng perforin tạo ra những lỗ hổng vi thể trên màng bào tương gây nên dòng Ca2+ tràn vào khởi phát đáp ứng của màng bào tương và nhập bào nhanh granzymes và bất cứ chất nào gắn với bề mặt tế bào. Thật ra, ngõ vào phụ thuộc động học và kết quả là hình thành những thể nội bào khổng lồ chứa cả granzymes và perforin. Trong vòng vài phút, granzymes thoát ra (thông qua những lỗ perforin trong thể nội bào) và tìm đường đi đến bào chất. Ở một số mô hình khác granzymes chuyển chỗ trước hết thông qua những lỗ kích thước có hạn có thể sửa chữa được của màng tế bào và không phải do những túi nội bào vỡ ra.

Nghiên cứu gần đây cho thấy họ serine esterase này có thể hoạt hoá ít nhất 3 con đường chết tế bào khác nhau. Granzyme B hoạt hoá con đường caspase apoptosis bằng cách cắt đứt caspase 3. Tuy nhiên, có bằng chứng rằng nó cũng hoạt hoá những con đường chết tế bào khác (đặc biệt trong ty thể và nhân) và vẫn còn được nghiên cứu. Do vậy, granzyme B của người, chứ không phải enzyme của chuột, hoạt hoá quá trình chết tế bào bằng cách trực tiếp cắt đứt cơ chất caspase, Bid và chất ức chế DNaseđược hoạt hoá bởi caspase (ICAD), để hoạt hoá những con đường huỷ hoại ty thể và DNA tương tự như caspases. Kết quả là các chất ức chế caspase có tác động nhỏ đến sự chết tế bào do granzyme B ở người và sự phân mảnh DNA, trong khi những chất ức chế tương tự ngăn chặn hoạt động của enzyme chuột. Con đường ty thể granzyme B (và caspase) dẫn đến việc sản xuất ROS, mất MMP, với sự phóng thích cytochrome c và những phân tử tiền apoptosis khác từ khoảng gian màng ty thể. Granzyme B người hoạt hoá trực tiếp con đường này (bằng cách cắt đứt Bid) trong khi enzyme chuột hoạt hoá gián tiếp. Mục tiêu khác của granzymes là nhân tế bào. Granzyme A và B nhanh chóng di chuyển đến nhân tế bào., nơi quá trình phân cắt ly giải những cơ chất chính rất quan trọng trong việc tạo ra chết tế bào theo lập trình bởi 2 enzyme này xảy ra. Sự di chuyển đến nhân tế bào của granzymes có lẽ được hỗ trợ bởi importin-α. Chúng ta mới phần nào hiểu được cách thức các granzymes khác ngoài B hoạt hoá chết tế bào vì các phòng thí nghiệm đã chỉ mới bắt đầu giải mã những dạng tái tổ hợp hoạt động của cácenzymes này. Điều mới được sang tỏ gần đây là granzyme A hoạt hoá sự chết tế bào với những đặc trưng hình thái của apoptosis nhưng hoà toàn độc lập với caspase và liên quan đến những con đường làm huỷ hoại ty thể và DNA,. Hơn nữa, granzyme C (ở chuột) và granzyme H (ở người) cũng hoạt hoá sự chết tế bào độc lập với caspase với kiểu hình ty thể. Có vài chứng cứ cho rằng granzyme M có thể hoạt hoá sự tự thực.

Những lộ trình phụ thuộc và không phụ thuộc các Caspase khác

Có thêm 2 proteases không phải caspase bên cạnh granzymes đã được xem như là chất phản ứng của apoptosis.

1.      Họ cathepsin bao gồm cysteine, asparte và các serine proteases. Cathepsin B và cathepsin L, cả cysteine proteases và cathepsin D, aspartate protease đều có liên hệ thường xuyên đến apoptosis. Những proteases này nằm trong lysosome và/hoặc các thể nội bào, nhưng chúng di chuyển ra tế bào chất trong suốt apoptosis. Các cathepsin có thể phân cắt một số lượng các cơ chất bao gồm các chất trong họ Bcl-2 như p53, cyclin D, c-Fos và c-Jun.30. Vả lại hoạt động của cathepsin được chứng minh là có liên quan đến MMP(matrix metalloproteinase), sự cô đặc nhiễm sắc chất, sự ly giải protein của chất nền nội bào, sự xử lý các chất tiền caspase và biểu hiện phosphatidyl serine (PS) ra ngoài màng bào tương của tế bào bị apoptosis. Một cơ chế gần đây cho rằng MMP qua trung gian cathepsin và apoptosis không phụ thuộc caspase liên quan đến apoptosis kết hợp lysosome tạo ra protein LAPF thúc đẩy tính thấm hoá của màng lysosome và phóng thích cathepsin vào những tế bào fibrosacoma. Cathepsin K là một enzyme đặc biệt tiết ra từ osteoclast giện diện trong quá trình phá hủy và tạo mới mô xương.

image

Hình 46.11: cathepsin K phá hủy nền apatite.

image

Hình 46.12: phân tử cathepsin K.

2.      Calpain là một họ protein mà hoạt tính thủy phân các protein khác lệ thuộc vào nồng độ Ca++ (calcium-dependent proteolytic activities) nội bào, họ calpain của cysteine proteases có mặt trong bào chất. Cả μ-calpain và m-calpain đều có liên hệt với những quá trình của apoptosis và các tình trạng bệnh lýcó mất một lượng lớn tế bào (ví dụ bệnh Alzheimer’s và bệnh Parkinson’s) có liên hệ trực tiếp đến hoạt động khác thường của calpain. Các calpain được hoạt hoá bởi sự tăng bất thường nồng độ Ca2+ tự do trong nội bào. Trong lúc một vài nghiên cứu cho rằng không có hoạt động caspase trong suốt quá trình apoptosis được điều biến bởi calpain, thì lại có những nghiên cứu khác ngụ ý rằng hoạt động ly giải protein được tăng cường trong apoptosis thông quamột vòng lặp khuếch đại hướng về nguồn cung cấp có liên quan đến các caspases. Ngoài ra, một “dòng thác calpain-cathepsin” cũng đã được đề xuất để tích hợp và nâng cao hoạt động phân giải protein trong quá trình apoptosis.

Cuối cùng, sự hư hại DNA có thể phát tín hiệu cho sự hoạt hoá caspase 2. Cơ chế phân tử của tiền caspase (procaspase) 2 trong quá trình apoptosis vẫn còn chưa được xác định. Vài báo cáo cho rằng capase 2 liên quan đến việc phóng thích cytochrome c và cần thiết cho quá trình apoptosis gây ra bởi dược phẩm trong vài dòng tế bào người. Dựa vào những dữ liệu này, caspase 2 được xem như chất khởi phát caspase trong apoptosis gây độc tế bào do stress hoạt động ngược dòng ty thể. Cũng có lúc, các tác giả khác cho rằng hoạt hoá caspase 2 xảy ra xuôi dòng lộ trình của ti thể. Thêm vào đó, caspase 2 được xem là 1 chất trung gian ở đầu gần trong apoptosis gây ra bởi shock nhiệt. Vai trò của caspase 2 trong việc phát tín hiệu của thụ thể chết cũng mâu thuẫn. Caspase 2 được xử lý trong apoptosis do thụ thể chếtlàm trung gian. Có nghiên cứu báo cáo rằng sự hoạt hoá này được điều biến bởi caspase 3 và do đó quá trình xử lý capase 2 xảy ra sau sự hoạt hoá caspase 3. Trái ngược với những dữ liệu này, caspase 2 được cho là cần thiết đối với sự phân cắt Bid tối ưu được điều biến bởi thụ thể chết. Ngoài ra, người ta cũng báo cáo rằng caspase 3 được hoạt hoá tại DISC nhưng không đóng vai trò trong việc khởi phát apoptosis gây ra bởi thụ thể chết.

image

Hình 46.13: phân tử calpain II.

Có nhiều con đường mà thông qua chúng, apoptosis có thể được hoàn tất và thêm vào các caspases, chúng ta đã phát hoạ ra nhiều ví dụ về những cơ chế chất tác động thúc đẩy tiến trình apoptosis trong các tế bào đang chết. Nghiên cứu tăng cường suốt 15 năm qua về những proteases đặc biệt này cho ta thấy rằng caspase có vai trò như “bánh xe” và là chất tác hiệu đặc hiệu cho apoptosis. Ngày càng nhiều các chất được tìm ra, những cơ chế chất tác động mới bắt đầu được biết đến. Hiện tại thì những cơ chế mới độc lập với caspase này còn chờ thêm thời gian để hoàn thiện.

Những vũ khí của tế bào đối với Apoptosis

Hiểu chi tiết về con đường của sự chết tế bào là con đường tốt nhất để hiểu được cơ chế quan trọng trong chuyển hóa tế bào bình thường và trong các tế bào đangc chịu áp lực từ stress từ môi trường bên ngoài..

image

Hình 46.14: sơ đồ hoạt hóa calpain lệ thuộc nồng độ calcium nội bào.

Caspases

Cơ chế chết được hoạt hóa bởi rất nhiều các tín hiệu trong đó trung tâm của các tín hiệu này là enzyme ly giải protein: caspase (cytenyl aspartate-specific protease). Dù apoptosis xảy ra theo cơ chế thì luôn có hiện tượng hoạt hóa những effector caspase chính yếu. Caspase có nhiệm vụ như binh đoàn kiếm mảnh của tế bào, có nhiệm vụ thực hiện các quá trình ly giải protein và tạo nên sự thay đổi ở kiểu hình (còn gọi là kiểu hình của apoptosis).

 

Cấu trúc và sự hoạt hoá caspase

Những caspases tạo thành một hệ thống dòng thác caspase đóng vai trò trung tâm trong việc tạo, truyền tính trạng và khuếch đại những tín hiệu nội bào của apoptosis trong quá trình xác định số phận tế bào, quá trình điều hoà miễn dịch và tăng sinh biệt hoá tế bào. Tính đến nay đã có 15 caspases của loài hữu nhũ được xác định. Chúng được chia thành 2 nhóm chính: (1) các caspase gây viêm (bao gồm các caspases 1, 4, 5, 11, 12, 13 và 14) và (2) các caspase liên quan đến apoptosis (bao gồm caspase 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10 và 15). Các caspases của apoptosis còn đươc chia nhỏ thành 2 nhóm nhỏ hơn là các caspases khởi phát và các caspases đao phủ. Caspase 2, 8, 9 và 10 kích hoạt apoptosis và được biết đến như là những caspases ngược dòng hay khởi phát. Chúng hoạt hoá các capases đao phủ hay xuôi dòng bao gồm caspases 3, 6, 7 và 15. Cuối cùng các caspase này sẽ thực hiện chết tế bào theo apoptosis.

Các caspases sử dụng tiểu phân cysteinenhư là nucleophile xúc tác đểđiều hòa nghiêm ngặt việc phân cắt các cơ chất sau các các aspartic acid trong proteinđích. Motif cấu trúc chính của chúng là một vùngchứa nhiều protease đồng đẳng caophân tử. Vùng này có thể chia nhỏ hơn thành 2 tiểu đơn vị, một tiểu đơn vị lớn khoảng 20kDa và một tiểu đơn vị bé khoảng 10kDa. Các tiền caspases cũng chứa một tiền vùng hay peptide đầu tận là amino với độ dài thay đổi. Các caspase khởi phát apoptosis có những tiền vùng có ít hơn 100 amino acids, trong khi những tiền vùngs của effector caspases thường chỉ có ít hơn 30 amino acids. Những tiền vùng dài này chứa đựng một motif riêng biệt, đáng chú ý nhấtlà vùng chết (DD). DD là thành viên của họ thụ thể TNF và có 2 vùng nhỏ hơn: vùng tác hiệu chết (death effector domain, DED) và vùngtuyển lựa caspase (caspase-recuitment domain, CARD) có vai trò tuyển chọn các caspases cho màng bào tương trước khi hoạt hoá. Tiền caspase-8 và -10 có2 DED sóng đôi trong tiền vùng của chúng. Trong số các caspases liên quan đến apoptosis, CARD được tìm thấy trong tiền caspase 2 và 9. DED và CARD bao gồm 6-7 vòng xoắn α bất đối xứng phân cực liên kết với những proteins khác bằng liên kết tĩnh điện hay liên kết kỵ nước. Thật vậy, tất cả caspases tồn tại trong tế bào dưới dạng zymogentiền chất tiềm ẩn không hoạt động hay proforms. Những kích thích nội bào và ngoại bào đặc biệt dẫn đến việc thành lập những phức hợp truyền tín hiệu gây ra cái chết (death-inducing signaling, DISC). Vùng DED và CARD có trách nhiệm lựa chọn những caspases khởi phát vào các phức hợp này. Điều này tạo thuận lợi cho sự tự hoạt hoá ly giải protein của những caspase đỉnh. Sự hiện diện Asp ở vị tríphân cắt trưởng thành (maturation cleavage site)giúp cho các caspases tự hoạt hoá hay được hoạt hoá bởi những caspases khác, chúng có vai trò như mộtsự kiện xảy ra trong thác khuếch đại. Sau khi hoạt hoá, tiền vùng được phóng thích từ proenzyme nhờ việc cắt đứt kiên kết Aps-X giữa protein này và tiểu đơn vị lớn. Tương tự đối với các tiểu đơn vị xúc tác lớn và nhỏ, p20 và p10 được tách ra thông qua sự phân cắt thứ hai tại liên kết Asp-X giữa hai vùng này.

Các caspases với tiền vùng ít hơn 30 amino acid như caspase 3, 6 và 7 được hoạt hoá bởi quá trình ly giải protein do các caspases khác hoặc granzyme B. Caspases có tiền vùng ngắn chắc chắn cần được hoạt hoá trong khi caspase 9 và những caspase khác với tiền vùng dài có thể hoạt động ngay cả ở trạng thái không được hoạt hóa. Các caspase xúc tác trưởng thành có trong một tetramer gồm 2 tiểu đơn vị lớn và 2 tiểu đơn vị nhỏ là phức hợp heterodimer (p20, p10)2 và vì thế chúng có 2 vị trí hoạt động ở 2 đầu đối lập của phân tử.

Cơ chất

Các caspases gắn với cơ chất của chúng thông qua các liên kết của rãnh hoạt động với các motifs amino acid trong cơ chất riêng biệt của từng caspases hoặc từng nhóm caspase có liên hệ chặt chẽ với nhau. Những yếu tố chính quyết định đặc điểm của cơ chất được định vị bên trong tiểu đơn vị nhỏ và thông tin cụ thể về sự liên kết của các caspase với cơ chất của chúng hiện đã được xác định. Các caspase nhận ra các tetrapeptide (P4-P3-P2-P1) motif trong cơ chất của chúng (ví dụ DEVD, YVAD, DEAD), cắt đứt liên kết giữa amino acidP1 và amino acid đầu tận C liền kề trong chuỗi peptide. Aspartate là rất cần cho các caspases tại vị trí P1; tuy nhiên chính phần tử này tại vị trí P4 mới là quan trọng nhất để xác định đặc điểm cơ chất của từng caspases. Nhưng đặc điểm của cơ chất là một lĩnh vực chưa được nghiên cứu kỹ ở nhiều loài. Sự xuất hiện phổ biến của những trình tự phù hợp với cơ chất chuyên biệt của caspases trong protein nội bào, sẽ cho thấy vô số (khoảng vài trăm) cơ chất trong cơ thể.

Thật vậy,ngày càng có nhiều proteins được phân cắt bởi caspases trong cơ thể hay trong ống nghiệm được tìm thấy. Những nghiên cứu kết luận rằng các caspase cắt đứt những thành phần cấu trúc chính cũa bộ khung tế bào và nhân, cũng như nhiều protein liên quan đến những lột trình tính hiệu. Những cơ chất này được phân loại thành protein bào tương (actin, gelsolin, α-fodin: spectrin không hồng cầu , adherin, thành phần kết nối β-catenin (junction components β-catenin), plakoglobin, protein sợi trung gian keratin 18, rabaptin-5: proteinhợp nhất thể nội bào, ser-pin: chất hoạt hoá ức chế plasminogen -2), các protein nhân (lamin-A, B; thụ thể lamin B, protein bộ máy nguyên phân nhân: NuMA, protein bám RNA và protein liên hệ với ribonucleoprotein, protein liên kết khung chromosome), protein chuyển hoá và sửa chữa DNA (PARP, DNA-PKcs, protein sao chép DNA, DNAtopoisomerases, RNA-polymerase), protein kinases (PKC và các đồng phân của nó; MAPK, ERK, Akt, Wee1), protein lộ trình truyền tín hiệu (prointerleukin cytokines, phospholipases), protein chu kỳ tế bào và tăng sinh tế bào (p21, p27, pRB, proteins được gắn với ubiquitin), protein liên quan với bệnh di truyền người,các proteins liên quan với apoptosis khác. Rõ ràng là những cơ chất này đại diện cho một nhóm các proteins mà chỉ một subset tương đối nhỏ cơ chất caspase là “những kẻ ngoài cuộc vô tội (innocent bystander)” và sự ly giải chúng đóng góp rất nhỏ vào quá trình.

Vì lý do này, hệ quả của nhiều sự kiện chia tách cơ chất diễn ra trong quá trình apoptosis vẫn là chủ đề nóng hiện nay. Ngoài ra, các bộ các caspases khác nhau được hoạt hoá cắt đứt những cơ chất khác nhau trong những tế bào khác nhau dựa trên hậu quả sinh lý khác nhau giữa các tế bào, các caspases và loại stress. Thật thú vị là các cơ chất caspase ở động vật có vú rất giống các cơ chất đặc trưng ở các loài động vật có xương sống khác.

Cơ chế điều hòa

Vai trò then chốt của sự hoạt hoá caspase trong những sự kiện chết gần hết tế bào cho thấy nên có những cơ chế để phòng ngừa hay giảm thiểu sự hoạt hoá của chúng. Thật vậy, ở những tế bào bình thường, sự biểu hiện, xử lý, hoạt hoá và bất hoạt các caspases được điều khiển một cách chính xác bởi những cơ chế khác nhau bởi những chất ức chế hoặc chất hoạt hoá khác nhau. Ở những động vật có vú, sự điều hoà giải mã và sau dịch mã của những genes tiền caspase thay đổi tuỳ theo loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên, những nghiên cứu chi tiết vẫn còn rất ít. Ngược lại, sự điều hoà hoạt động của các caspases thì được nghiên cứu nhiều. Hoạt động của các caspases được điều hoà ở nhiều mức độ bao gồm ngăn chặn hoạt hoá caspases tại DISC cũng như ức chế hoạt động enzyme của caspase. Có ít nhất 3 loại chất điều hoà caspases khác nhau tên là IAPs, FLIP và calpain đã được xác định.

Protein ức chế apoptosis (inhibitor of apoptosis proteins, IAPs) là họ của proteins tế bào được tìm thấy lần đầu trong các tế bào côn trùng bị nhiễm baculovirus. IAPs gồm có 8 thành viên được tìm thấy ở động vật có vú với những mô hình được bảo tồn cao và biểu hiện phân biệt trong các mô khác nhau. Ở người, đã có 6 IAP được xác định như NAIP (protein ức chế apoptosis trong tế bào thần kinh, c-IAP1/HIAP-2, c-IAP2/HIAP-1, XIAP/hILP (protein liên kết với NST X ở động vật có vú, ức chế apoptosis), survivin và BRUCE (một protein màng ngoại vi được bảo tồn 528kDa của mạng lưới giữa các Golgi). Một đặc điểm của IAP là sự hiện diện của 1-3 bản sao vùng mới gồm 70-80 amino acids được gọi là chuỗi lặp lại IAP baculovirus (baculovirus IAP repeat BIR), cho thấy một liên kết chặt với kẽm có thể bám vào bề mặt các caspases, ngăn chặn rãnh xúc tác của các enzymes này. Vài IAPs của động vật hữu nhũ không những có vùngs BIR mà còn có một cấu trúc dạng vòng ởđầu tận C liên quan đến hoạt động của ubiquitin-ligase. Vùng nối tiếp giữa vùngs BIR1 và BIR2 đích có chọn lọc hướng đến caspases 3 và 7, trong khi vùng BIR thứ 3 (BIR3) liên kết với caspase 9. Do đó IAPs ức chế chuyên biệt hoạt động của những caspase tác động 3 và 7 cũng như caspase khởi phát 9. IAPs không gắn hay ức chế caspase 8, nhưng chúng vẫn gắn và ức chế procaspase 3 là cơ chất của nó, vì vậy IAP có vai trò bảo vệ tế bào khỏi apoptosis gây ra bởi Fas/caspase 8.­ Trong lộ trình ty thể, sự bất hoạt caspase được điều hoà bởi XIAP, c-IAP1 và c-IAP2 gắn trực tiếp với procaspase 9, ức chế sự xử lý và hoạt hoá bởi cytochrome c. Sự biểu hiện quá mức của proteins IAP ức chế apoptosis gây ra bởi Bax và những protein tiền apoptosis thuộc họ Bcl-2. Không phải tất cả protein chứa BIR đều là chất ức chế caspase hay apoptosis. Survivin chỉ chứa 1 vùng BIR có thể hoạt động như một chất điều hoà nguyên phân hơn là apoptosis. Hơn nữa, vùngs BIR cũng là những vị trí làm các protein của apoptosis ( như các protein xuất phát từ ty thể Smac/DIABLO và HtrA2/Omi) tập trung, tác động đối kháng lại chức năng chống apoptosis của IAPs.

IAPs không phải là chất ức chế tự nhiên duy nhất của caspases, và FLIP, p35 của baculovirus, calpain, hay Ca2+ là những chất điều hoà khác. Protein FLIP là những đồng đẳng caspase không hoạt động có vị trí xúc tác của chúng bị làm hư hại và là những chất điều biến ưu thế âm của dòng thác caspase. Có 2 nhóm FLIP chính: FLIP của virus (v-FLIP) được mã hoá bởi virus gamma herpes, và FLIP của loài có vú hay FLIP tế bào (c-FLIP). Cả v- và c- FLIPs đều có 2 DEDs sóng đôi tại đầu tận N tạo thuận lợi cho việc tuyển chọn chúng cho DISC. Dưới điều kiệu biểu hiện quá mức, tất cả đồng phân ức chế sự hoạt hoá procaspase 8 tại DISC bằng cách ngăn chặn quá trình xử lý của chúng. Cùng lúc đó, tại DISC, nồng độ thấp của đồng phân c-FLIP tạo thuận lợi cho sự cắt đứt procaspase 8 bằng cách tạo thành heterodimer với tiền caspase này.

Protein p53 của baculovirus là một chất ức chếcaspase, nó nhắm đến phần lớn caspases bằng cách tạo thành một phức hợp ức chế cùng với chúng. p35 của baculovirus là một chất ức chế hiệu quả caspase. Một chất ức chế pan-caspase khác là ser-pin CrmA, có nguồn gốc từ virus đậu bò. Protein này liên kết hoá trị với trung tâm hoạt động của các caspases. Nó là chất ức chế mạnh caspase 1 và 8, và là một chất ức chế yếu caspase 3 và 6. Tuy nhiên, cơ chế mà những thành viên của họ caspase tác động lẫn nhau và tác động đến những factor tiền apoptosis và chống apoptosis khác vẫn còn chưa được biết rõ.

Calpain là một dạng protease cyteine phụ thuộc Ca2+. Calpain và caspase 3 có chung nhiều cơ chất bao gồm fodrin, một protein kinase phụ thuộc Ca2+, và ADP ribosyltransferase/PARP. Trong cái chế tế bào gây ra bởi stress của lưới nội bào (ER), vai trò của calpain đặc biệt quan trọng vì cân bằng nội môi Ca2+ bị đảo lộn. Trong những tế bào não của chuột cống bị thiếu máu cục bộ một bên do giảm oxy, đầu tiên, m-calpain phân cắt procaspase 3 thành những phân đoạn 29kDa, tạo điều kiện cho sự phân cắt và hoạt hoá hơn nữa của nó. Cisplatin, một dạng tác nhân chống ung thư, có thể gây stress ER và apoptosis. Trong suốt quá trình này, sự hoạt hoá procaspase 12 bởi cisplatin phụ thuộc vào Ca2+ và calpain. Calpain cũng phân cắt Bcl-xL để chuyển đổi một phân tử tiền apoptosis thành một phân tử chống apoptsis.

Thụ thể chết

Các thụ thể chết là những thụ thể cytokine ở bề mặt tế bào thuộc siêu yếu tố hoại tử khối u/ yếu tố tăng trưởng dây thần kinh (TNF/NGF). Những thụ thể này truyền các tín hiệu apotosis được khởi phát bởi các ligand chết (death ligand), hoạt hoá dòng thác caspase trong vài giây. Chúng là những protein xuyên màng với đuôi tận C nằm trong tế bào, khung màng tế bào, và một vùng đầu N ngoài tế bào gắn với ligand. Các thụ thể chết được đặc trưng bởi sự tương đồng đáng kể trong một vùng có chứa 1 đến 5 đoạn lặp lại giàu cysteine trong vùng ngoại bào của chúng, và trong chuỗi 60-80 amino acids tế bào chất được gọi là vùng chết (DD), nó tuyển lựa các protein xuôi dòng apoptosis.

Truyền tín hiệu bởi những thụ thể chết được khởi phát bởi sự trimer hoá thụ thể này, được kích hoạt khi các vùng nội bào kề nhau, theo sau sự tham gia của ligand đến vùng ngoại bào của thụ thể. Sự kiện này dẫn đến sự tuyển chọn những protein thích ứng khác nhau, cung cấp cầu nối giữa thụ thể của các caspase tác hiệu của tế bào(ví dụ caspase 8 và caspase 10). Các protein thích ứng (adapter protein) thường không có hoạt động enzyme của chính mình, nhưng có thể liên hệ với những thụ thể thông qua các liên kết với các kháng nguyên chuyên biệt của DD thụ thể và một DD tương tự trên chính protein thích ứng đó. Các proteins thích ứng có thể chứa một vùng tác động đến cái chết (death effector domain, DED) làm trung gian cho sự lựa chọn caspase thông qua kết hợp với một DED tương ứng trên vùng tuyển lựa caspase (CARD) trong tiền vùng của các caspase khởi phát không hoạt động. Phức hợp cuối cùng được gọi là phức hợp truyền tín hiệu gây chết (death inducing signaling complex, DISC). Sự gần nhau của một số phân tử caspase được tuyển chọn vào các thụ thể đưa đến quá trình tự xử lý và hoạt hoá caspase, thông qua hoạt động ly giải protein nhẹ của bản thân procaspase. Caspase khởi phát được hoạt hoá này sau đó khởi động một dòng thác hoạt hoá caspase bằng cách hoạt hoá các caspases tác động (ví dụ caspase 3, caspase 6 và caspase 7), trực tiếp hay gián tiếp chịu trách nhiệm cho sự thực hiện cái chết tế bào. Ngoài ra, caspase khởi phát có thể cắt ngững cơ chất khác gây ra sự huỷ hoại chức năng của ty thể (ví dụ sự phân cắt Bid), và hoạt hoá những caspase tác động thông qua việc phóng thích những yếu tố tiền apoptosis của ty thể. Sau khi tín hiệu apoptosis được kích hoạt, DISC được tiếp nhận ở nơi chúng phân tách (nơi có pH thấp). Vì vậy các thụ thể chết có thể hoạt động như những kíp nổ của những hộp thuốc nổ gắn vào màng bào tương và bùng nổ do những kết hợp chính xác các ligands chuyên biệt ngoại bào của chúng.

 Hiện nay những thụ thể chết được mô tả bao gồm Fas (còn gọi là CD05, APO-1), TNFR-1 (còn gọi là p55, CD120a), DR3 (còn gọi là APO-3, WSL1, TRAMP, LARD), DR4 (TRAIL-R1), DR5 (APO-2, TRAIL-R2, chất huỷ diệt), và thụ thể chết 6 (DR6). Những dòng thác truyền tinthì hơi khác, nhưng người ta vẫn chưa hiểu rõ về những lộ trình phức tạp này.

Cơ chế truyền tín hiệu của Fas

image

Hình 46.15: Fas & Fas ligand và lộ trình tín hiệu của nó.

Fas hay CD5 là một protein 45-54 kDa được glycosyl hoá ở bề mặt tế bào và được tìm thấy ở rất nhiều mô khác nhau, đặc biệt có nhiều trong tuyến ức, gan, tim, thận và các tế bào lympho trưởng thành được hoạt hoá và những tế bào lympho bị virus biến đổi. Đa số Fas được tìm thấy ở dạng gắn với màng hơn là dạng hòa tan. Tác động chống apoptosis của những dạng thụ thể hoà tan này đã được xác định, nó có thể trung hòa tính gây độc tế bào qua trung gian Fasbằng cách gắn và bất hoạt Fas ligand (FasL). Hơn nữa, Fas ở trong bào chất, đặc biệt là trong bộ Golgi và mạng lưới giữa các Golgi với nhau.Quá trình chuyển những túi chứa Fas đến bề mặt tế bào đã được hiểu rõ. Đó một cơ chế hiệu quả để điều hoà mật độ màng bào tương của thụ thể chết và tránh sự hoạt hoá tự phát. Apoptosis qua trung gian Fas có thể cũng được điều biến bằng cách glycosyl hoá thụ thểnày hay ở mức độ dịch mã, quá trình được điều hòa bằng cách điều hoà trực tiếp sự biều hiện của nó. Một vị trí gắn cho yếu tố dịch mã NF- κ B đã được xác định, và yếu tố đáp ứng với p53 cũng được định vị trong gene Fas.

FasL là một protein 40kDa xuyên màng với cấu trúc homotrimer được biểu hiện trên bề mặt của những tế bào T được hoạt hoá vào tế bào diệt tự nhiên. Nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng nội môi tế bào T và B ngoại biên, và trong việc giết những tế bào gây hại như những tế bào bị nhiễm virus hay tế bào ung thư và giết những tế bào viêm tại những vị trí ưu tiên cho miễn dịch như mắt. Sự tham gia của Fas với ligand của nó (hoặc với kháng thể Fas đơn dòng) dẫn đến sự trimer hoá của thụ thể được theo sau bởi sự tuyển chọn phân tử thích ứng FADD (protein liên quan đến Fas với vùng chết). FADD là một protein nặng 28kDa trong bào chất  được biểu hiện phổ biến với vùng chết ở đầu tận C và một DED tại đầu tận N. FADD liên hệ với thụ thể Das thông qua DD của nó, trong khi DED cần trong sự liên hệ của chính nó với procaspase 8. Sự tuyển chọn và tích luỹ procaspae 8 tại DISC dẫn đến sự hoạt hoá tự phát caspase này thông qua quá trình ly giải tự phân cắt và khởi phát tín hiệu apoptisis. Procaspase 10 cũng được tuyển lựa và hoạt hóa tại Fas DISC với động học tương tự như procaspase 8. Cả hai enzyme có thể khởi phát apoptosis độc lập lẫn nhau.

Hạ nguồn tín hiệu của sự hình thành DISC khác nhau giữa các loại tế bào. Trong những tế bào loại I, lượng lớn caspase 8 được hoạt hoá tại DISC và sau đó các caspase nàyđược phân cắt nhanh. Quá biểu hiện protein Bcl-2 chống apoptosis hoặc Bc-xL không ngăn ngừa được sự hoạt hoá caspase 8 hoặc caspase 3 trong những tế bào này, và cũng không ức chế apoptosis. Điều này cho thấy sự hoạt hoá độc lập ty thể của dòng thác caspase. Ngược lại, thành lập DISC trong những tế bào loại II bị giảm thiểu mạnh và hoạt hoá caspases, bao gồm caspase 8, xảy ra chủ yếu ở hạ nguồn ty thể vì cả quá trình hoạt hoá caspase và apoptosis có thể bị ngăn chặn bởi sự biểu hiện quá mức Bcl-2 hoặc Bcl-xL. Đáng chú ý là Fas kích hoạt sự hoạt hoá ty thể ở cả loại tế bào I và II, và trong cả 2 loại, hoạt động sinh apoptosis của ty thể bị ngăn chặn bởi sự biểu hiện quá mức của Bcl-2 hoặc Bcl-xL. Tuy nhiên, chỉ trong tế bào loại II mà không phải trong tế bào loại I, sự biểu hiện quá mức Bcl-2 hoặc Bcl-xL ngăn apoptosis xảy ra. Vì vậy chỉ trong tế bào loại II, ty thể cần thiết cho sự thực hiện chương trình apoptosis, trong khi ở tế bào loại I, rối loạn chức năng ty thể có thể là sự khuếch đại tín hiệu apoptosis.

Sự điều hoà tốt truyền tín hiệu Fas là cần thiết để tránh kích hoạt chết tế bào không cần thiết và để đảm bảo hoạt động chính xác của cỗ máy apoptosis. FLIP là những protein chứa DED, điều hoà apoptosis qua trung gian Fas. DED của FLIP gắn với phức hợp Fas-FADD và ức chế sự lựa chọn và hoạt hoá procaspase 8 qua đó đóng vai trò như là một phân tử chống apoptosis.

Cơ chế truyền tín hiệu bằng yếu tố hoại tử u (TNF)

Hệ thống truyền tín hiệu TNF/ thụ thể TNF gồm có 2 thụ thể khác nhau, TNF-R1 và TNF-R2, và 3 ligands: TNF-α gắn với màng, TNF-α hoà tan và TNF-β hoà tan có nguồn gốc từ tế bào lympho. TNF đều là những protein xuyên màng với những đặc tính cấu trúc tương tự nhau, bao gồm vùng ngoại bào đầu tận N giàu disulfur nhận ra TNF, một vòng xoắn xuyên màng và một đuôi trong tế bào chất. Tuy nhiên chỉ TNF-R1 có DD nội bào (TNF-R2 không có), và vì vậy nó có thể là một chất trung gian duy nhất của tín hiệu apoptosis trong hầu hết các loại tế bào, cũng như trong các nghiên cứu trong cơ thể con người(in vivo).

Những tín hiệu nội bào xuất phát từ TNF-R1 rất phức tạp và có thể dẫn đến những đáp ứng tế bào đa dạng, thậm chí là trái ngược từ quá trình tăng sinh tế bào đến quá trình viêm và cuối cùng đến chết tế bào. Hầu hết các tế bào đều được tiếp xúc với TNF-α, tuy nhiên apoptosis xảy ra trừ phi protein tổng hợp RNA bị ngăn chặn. Điều này cho thấy ưu thế những tín hiệu sống còn cao hơn những tín hiệu chết trong điều kiện bình thường, và cần có sự tổng hợp protein mới để kềm lại kích thích apoptosis. Sự biểu hiện của những protein chống apoptosis này có thể được điều khiển bởi hoạt động của yếu tố dịch mã NF-κB.

Sự tham gia của TNF-R1 bởi TNF-α dẫn đến sự trimer hoá và những thay đồi hình dạng trong vùng nội bào của thụ thể, dẫn đến sự tuyển chọn nhanh va nhiều loại proteins thích ứng trong tế bào chất chứa DD, và một lần nữa thông qua liên kết phân cực với DD của thụ thể. TNF-R1 không được kích thích liên kết với SODD (silencer of death domain) mới được phân lập, ngăn ngừa hiệu quả sự tự tổng hợp DD và khởi phát tự ý sự truyền tín hiệu. Khi được kích hoạt, SODD tách khỏi TNF-R1 để protein thích ứng protein liên quan với TNF với vùng chết (TNFR-associated protein with death domain, TRADD) gắn với thụ thể DD bị gom lại. TRADD hoạt động như là một protein neo, lựa chọn nhiều phân tử truyền tin để hoạt hoá thụ thể như FADD, TRAF-2 (yếu tố liên hệ TNF-2), RIP (protein liên kết với thụ thể) và RAIDD (protein đồng đẳng ICH-1/CED-3 liên hệ RIP với vùng chết). Những protein này không có hoạt động enzyme, ngoại trừ RIP,enzyme này có hoạt tính serine-threonine kinase. Vai trò của kinase này trong apoptosis vẫn chưa được biết nhưng chúng có vai trò làm trung gian chết tế bào gây ra bởi thụ thể chết không phải apoptosis. FADD gắn và hoạt hoá caspase, thúc đẩy apoptosis thông qua một lộ trình tương tự giống như lộ trình được kích hoạt bởi Fas. RIP gắn với RAIDD, tham gia lộ trình gây chết bằng cách tuyển chọn caspase 2 thông qua liên kết phân cực giữa những trình tự đồng dạng trong vùng tận cùng là amino và provùng của caspase 2. RIP cũng liên hệ với TRAF-2, khởi phát những lộ trình tiền sống sót và điều hoà đáp ứng miễn dịch.

Lộ trình apoptosis này được điều khiển của những sản phẩm từ gene. Apoptosis được điều biến thông qua FADD – bản thân FADD lại được điều hoà bởi FLIP (protein ức chế Flice, casper: CASH, MRIT) và ức chế caspase khởi phát. FLIP cũng ức chế tín hiệu chết bởi TNFR-1 thông qua những liên kết với DED của FADD. Những nghiên cứu gần đây đã cho ta biết rằng FLIP cũng ức chế apoptosis bằng cách hoạt hoá những tín hiệu sống còn. Những bản báo cáo cho thấy TNFR-2 thiếu một vùng chết trong tế bào chất, thay vào đó là liên kết giữa TNFα và TNFR-2 dẫn đến sự gắn kết TRAF-1 và TRAF-2 vào thành phần TNFR-2 trong tế bào chất. TNFR-2  tạo điều kiện cho apoptosis được ra bởi TNFα bằng cách trở thành bẫy ái lực cao với TNFα và phân phối chúng cho TNFR-1.

Cơ chế truyền tín hiệu bởi thụ thể TRAIL

Từ khi phát hiện những thành viên mới của họ TNF, ligand gây ra apoptosis liên quan với TNF, TRAIL (cũng được gọi là APO-2L), đã có 5 thụ thể cùng nguồn gốc khác nhau gắn với nó. Hai trong số đó, TRAIL-R1 (còn gọi là DR4) và TRAIL-R2 (còn gọi là DR5 hay Killer hay TRICK2) được xem là những thụ thể chết thật sự vì chúng tham gia với TRAIL gây ra apoptosis. Cấu trúc của TRAIL-R1 và TRAIL-R2 phù hợp với cấu trúc của những thụ thể chết với DD cần thiết để truyền tín hiệu apoptosis. TRAIL-R1 được tìm thấy ở phần lớn các mô của con người, bao gồm lách, tuyến ức, gan, bạch cầu trong máu ngọai biên, những tế bào T được hoạt hoá, ruột non và vài dòng tế bào ung thư.TRAIL-R2 được tìm thấy ở cả mô lành và những dòng tế bao ung thư, nhưng đặc biệt nhiều trong lách, bạch cầu máu ngoại biên và bạch cầu được hoạt hoá. 2 loại thụ thể TRAIL khác là TRAIL-R3 (còn gọi là DcR1 hay TRID hay LIT) và TRAIL-R4 (DcR2/TRUNDD) cũng được gọi là những thụ thể mồi. Mạc dù khá giống với TRAIL-R1 và TRAIL-R2 ở vùng ngoại bào vào xuyên màng, TRAIL-R3 và TRAIL-R4 thiếu vùng chết hoặc có một vùng chết không chức năng. Vì vậy mà sự gắn kết của TRAIL với các thụ thể không kích hoạt apoptosis được. Bản dịch mã TRAIL-R3 và TRAIL-R4 được tìm thấy trong những mô lành của người mà không có trong phần lớn các dòng tế bào ung thư.Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho rằng điều hoà nội bào sự truyền tín hiệu TRAIL gây ra tính kháng apoptosis qua trung gian TRAIL của các tế bào bình thường nhiều  hơn là do mật độ bề mặt của những thụ thể mồi. 50 thụ thể của TRAIL được tìm ra là thụ thể hoà tan osteoprotegerin (OPG). OPG cũng có thể hoạt động như là một thụ thể mồi vì nó gắn hiệu quả với TRAIL nhưng không tạo ra apoptosis.

Giống những ligands khác của họ TNF, TRAIL cũnglà những protein xuyên màng. Đầu tận Cngoại bào của nó cho thấy sự tương đồng đặc biệt với những thành viên khác cùng họ. Tuy nhiên, đầu tận Nnằm trong tế bào chất ngắn hơn đáng kể và không được bảo tồn ở các loài. Dạng hoạt động sinh học của TRAIL là một homotrimer. TRAIL dường như kích hoạt apoptosis chuyên biệt ở những dòng tế bào ung thư hơn là những tế bào lành, mặc dù vậy ý kiến này vẫn chưa được giải thích cặn kẽ.

Giống như Fas, TRAIL-R1 và TRAIL-R2 được hoạt hoá để lựa chọn FADD, caspase 8 và caspase 10 cho DICSs riêng của chúng, và chúng kích hoạt apoptosis thông qua một lộ trình được kích hoạt giống Fas. Giống như Fas, apoptosis do TRAIL bị ức chế mạnh bởi sự biểu hiện nhiều FLIP, đó là yếu tố chính để xác định mức độ nhạy của tế bào với apoptosis do TRAIL. Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy TRAIL gây ra chết tế bào, thúc đẩy hoạt hoá NF- κB thông qua TRAF-2 và JNK bằng những lộ trình khác biệt và độc lập. Vì TRAF-2 không liên hệ trực tiếp với bất kỳ thụ thể TRAIL nào, có thể nhận thấy rằng lộ trình này cần một protein chuyển đổi hơn là TRADD hay FADD.

 

 

 

Truyền tín hiệu qua thụ thể chết 3 và 6

image

Hình 46.16:Thụ thể chết (death receptor) và lộ trình tín hiệu.

Thụ thể chết 3 (DR3) có sự tương đồng cao với TNF-R1, đặc biệt ở DD (death domain) của nó. Ligand tự nhiên của DR3 đã được xác định và đặt tên là ApoL3. Những đáp ứng và tín hiệu được kích hoạt bởi sự hiện diện quá mức DR3 hoặc khi gắn DR3 với ApoL3(tương tự như những đáp ứng và tín hiệu đó qua trung gian TNF-R1). Dù có sự giống nhau trong cơ chế truyền tin nhưng dựa vào sự biểu hiện khác nhau của các ligands và thụ thể, DR3 và TNF-R1 có thể có những vai trò sinh học khác nhau.

Thụ thể chết 6 (DR6) đã được xác định là một thụ thể chết mới dựa vào vùng ngoại bào giàu cysteine và DD nội bào của nó. Tuy nhiên, không giống những thụ thể chết khác, DD không khu trú ở đầu C mà nó ở sát vùng xuyên màng. DR6 được tìm thấy nhiều ở tuyến ức, lách và tế bào giống lympho. DR6 tham gia lộ trình chết tế bào ở những tế bào động vật hữu nhũ khác nhau bởi những thụ thể được khởi phát bởi những thụ thể chết khác vì có vẻ như nó không liên hệ với những phân tử chuyển đổi chứa DD như TRADD, FADD, RAIDD hay RIP. Khi DR6 hiện diện với số lượng nhiều chúng có vai trò như  một chất có hiệu lực gây hoạt hoá JNK và NF- κB. Khả năng hoạt hoá lộ trình JNK và việc DR6 có nhiều trong những cơ quan lympho cho thấy DR6 có vai trò trong hệ miễn dịch.

Protein Bcl-2

Cấu trúc và sự hoạt hoá

Một trong những tính năng chính của họ protein Bcl-2 là thành viên của nó có chung trình tự tương đồng trong 4 vùng(ví dụ:vùng BH1, 2, 3 và 4), tuy nhiên không phải tất cả các thành viên đều có tất cả vùng. Những nghiên cứu gây đột biến đã cho thấy những vùng này quan trọng cho nhữngchức năng phân tử và cho liên kết protein giữa các thành viên họ. Vùng BH1 và BH2 cần thiết cho chức năng kìm hãm cái chết của những phân tử chống apoptosis, trong khi vùng BH3 cần cho chức năng thúc đẩy cái chết của các phân tử. Thêm vào đó, vùng BH4, hiện diện trong những phân tử chống apoptosis, cũng có chức năng quan trọng là ức chế cái chết. Vì vậy những protein chống apoptosis Bcl-2 chứa vùng BH 1-4, trong khi những phân tử trước chết có thể chia thành các phân tử chỉ cóvùng BH3 và những phân tử cóvùng BH1-3. Có vẻ như những phân tử “chỉ có BH3” như Bid, Bim và Bad là những cảm ứng với tín hiệu chết từ phía bên ngoài và có thể hoạt hoá những phân tử đao phủ “đa vùng” Bx hay Bak. Tiến trình này giống dòng thác caspase ở vài điểm ở đó các caspase khởi phát hoạt hoá những caspase tác động.

Ở động vật có vú, ít nhất 12 protein chính thuộc họ Bcl-2 đã được xác định dựa trên sự giống nhau về cấu trúc 3D (cấu trúc ước đoán thứ cấp). Thêm vào đó, ngoài Bid ra, các cấu trúc ước đoán toàn diện của các protein chỉ có vùng BH3 dường như không liên quan và có lẽ thiếu mối quan hệ gầngũi về mặt tiến hoá với những thành viên chính của họ Bcl-2. Tuy nhiên tất cả các protein chỉ có vùng BH3 tương tác và điều hoà những protein chính của họ Bsl-2 để thúc đẩy apoptosis.

Những thành viên chống apoptosis của họ protein Bcl-2 là Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, (gene liên quan Bcl-2, đồng phân dài), A1 và Mcl-1 (Bệnh bạch cầu dòng tuỷ-1). Những thành viên tiền apoptosis là những phân tử tác động Bak (Bcl-2 antagonist killer 1, chất diệt đối vận Bcl-2 1) và Bax (Bcl-2 associated x protein, protein Bcl-2 liên quan NST X). Những protein chỉ có BH3 là Bad (Bcl-2 antagonist of cell death, đối vận Bcl-2 của chết tế bào), Bid (Bcl-2 interacting domain death agonist, đối vận Bcl-2 tương tác thụ thể chết), Bik (Bcl-2 interacting killer, chất diệt tương tác với Bcl-2), Bim(Bcl-2 interacting mediator of cell death, chất trung gian tương tác với Bcl-2 của chết tế bào), Bmf (Bcl-2 modifying factor, yếu tố bổ nghĩa Bcl-2), bNIP3 (BCL-2/adenovirus E1B 19-KD protein interacting protein 3, protein tương tác với protein BCL-2/adenovirus E1B 19kD 3), HRK (Harakiri), Noxa và Puma (p53-unregulated modulator of apoptosis, chất điều biến apoptosis được p53 điều hoà). Nhiều protein trên đã đượcloại bỏ ở chuột để bộc lộ những vai trò sinh lý, sự dư thừa và tương tác của chúng trong cơ thể. Những nghiên cứu sinh lý di truyền toàn diện của họ Bcl-2 đã tạo ra những hiểu biết quan trọng về nguồn gốc của những thành viên họ Bcl-2 và protein chỉ có vùng BH3 và nêu lên rằng rất nhiều protein hiệnnay có thể có những hoạt động vượt xa sự điều hoà chết tế bào.

image

Hình 46.17: cấu trúc phân tử của Bcl-2

Cấu trúc 3D của những 7 phân tử chính của họ protein Bcl-2 (như Bcl-2, Bcl-xL, Mcl1, Bax, Bak và Bid) chưa đủ làm sáng tỏ sự khác nhau nổi bật giữa các thành viên chống apoptosis (như Mcl1) và các thành viên tiền apoptosis (như Bx và Bid). Tất cả 7 protein này là những bó xoắn ốc với một vòng kẹp kỵ nước xoắn từng vòng một trên cả 2 mặt theo từng đôi xoắn phân cực. Chúng có những domains đầu tận C neo vào màng tế bào. Hơn nữa, Bid tiền apoptosis có vẻ như được myristoylated để điều biến cho sự neo đậu vào màng này. Ngoài ra,    3 proteins (Bax, Bcl-W và Mcl1) có mỏ neo đầu tận C vừa với một túi kỵ nước được tạo ra bởi vùng BH1, 2 và 3. Một túi tương tự cô lập neo đầu tận C có thể cũng gắn kết với những peptides của các chuỗi domain BH3 của Bak, Bad và Bim. Điều này cho thấy nó cũng có chức năng trong sự dimer hoá với các protein chỉ có BH3 và/hoặc các thành viên của họ   Bcl-2 chứa nhiều domain BH.

Sự hoạt hoá các protein chỉ có vùng BH3 xảy ra để đáp ứng với những kích thích khác nhau đặc hiệu cho từng thành viên của họ này và vì vậy những chất điều hoà của chúng đóng vai trò là những chất cảm biến đầu tiên cho stress tế bào. Sự biểu hiện protein chỉ có BH3 có thể được gây ra bởi những yếu tố dịch mã. Ví dụ như Noxa và Puma được tạo ra bởi chất ức chế tạo khối u p53 để đáp ứng lại với sự hư hại DNA và Bim được tạo ra trong đáp ứng với sự thiếu hụt yếu tố tăng trưởng và bởi nhiều yếu tố dịch mã để đáp ứng với stress lưới nội bào (ER).

Những protein chỉ có BH3 cũng có thể được hoạt hoá sau dịch mã, ví dụ Bad được hoạt hoá vì không được phosphoryl hoá trong đáp ứng với sự thiếu hụt yếu tố tăng trưởng. Bid được hoạt hoá khi bị caspase 8, granzyme B phân cắt. Ngoài ra, sự phân cắt yếu hơn bởi caspase 2, 3 dẫn đến đoạn tận cùng N bị cắt cụt (tBid) – chúng tham gia vào đáp ứng tương ứng với kích thích tử thụ thể, quá trình tiêu diệt tế bào lympho T gây độc tế bào và choáng tim.

Bim được giữ ở dạng bất hoạt trong tế bào thông qua việc gắn kết với phức hợp dynein vận động và được hoạt hoá khi được phóng thích từ bộ khung tế bào hay mất sự phosphoryl hoá qua trung gian kinase ngoại bào được điều hoà bởi tín hiệu (ERK).

Bmf được hoạt hoá khi được phóng thích từ những phức hợp vận động actin-myosin; và Bik được hoạt hoá bởi cơ chế chưa rõ để đáp ứng với sự ức chế sinh tổng hợp protein.

Sự điều hoà các mức độ biểu hiện của những protein tiền apoptosis của họ Bcl-2 là một con đường khác. Trong đó, tế bào có thể điều hòa apoptosis. Ví dụ, Bcl-xL có thể gây dịch mã bởi những yếu tố tăng trưởng để thúc đẩy sự sống sót của tế bào. Mcl-1 bị thoái giáng nhanh chóng bởi lộ trình ubiquitin-proteasome để đáp ứng với sự thiếu hụt cytokine hoặc những kích thích gây chết khác (như bức xạ tia cực tím UV) và có thể được điều hoà lên hậu địch mã để chống apoptosis bằnng việc ức chế tần suất thoái giáng.

Sự điều hoà các mức độ biểu hiện của protien tiền apoptosis Bx và Bak thì khó thấy hơn và các protein có vẻ như được biểu hiện ở những mức nhiều hay ít hằng định hơn. Bx và Bak được điều hoà nguyên phát hậu dịch mã bởi những thành viênc ủa họ Bcl-2.

Cơ chế hoạt động

image

Hình 46.18: lộ trình tín hiệu của BH3 và death receptor.

Những sự tương tác protein giữa các thành viên Bcl-2 là những bước quan trọng cho sự hoạt hoá và cơ chế hoạt động của chúng. Dựa vào những nghiên cứu trong ống nghiệm và cả trong cơ thể sinh vật, nhiều dạng tương tác có thể được xác định. Dạng thông dụng nhất là tương tác giữa những thàhn viên chống và tiền cái chết, như Bcl-2 với Bax hay Bid. Sự tương tác này có thể dẫn đến hoạt động đối vận của 2 loại phân tử và vì vậy có thể thiết lập một sự điều khiển biến trở của chương trình chết. Thật thú vị là không phải tất cả các phân tử chống cái chết có thể tương tác với tất cả các phân tử tiền cái chết. Dường như một vài thành viên của nhóm này sẽ gắn kết ưu thế hơn với một vài thành viên khác của nhóm kia. Ví dụ, Bok tiền chết gắn kết với Mcl-1 nhưng không gắn với Bcl-2, Bcl-Xl, hoặc Bcl-w. Một cách tương ứng, những phân tử này có thể chỉ đối kháng chức năng của những phân tử mà chúng gắn kết. Dạng chọn lọc này cho thất những amino acids đặc hiệu là cần thiết cho sự tương tác đặc biệt chỉ tồn tại trong một vài thành viên chứ không phải toàn thể họ protein này. Hơn nữa, điều này cũng cho thấy ràng ở những mô nhất định và cho những kích thích chết nhất định, một bộ các proteins đặc hiệu thuộc họ Bcl-2 có liên quan rất lớn.

Dạng tương tác thứ 2 xảy ra giửa hai thành viên tiền chết, thường là một phân tử chỉ có BH3 và một phân tử đa domain như Bid đến Bax hay Bak; và Bim đến Bax. Nhữnng sự tương tác như vậy quan trọng cho sự hoạt hoá những phân tử đao phủ đa domain, Bax hay Bak, bởi những phân tử cảm biến chỉ có BH3.

Dạng thứ ba là oligomer hoá của cùng một phân tử. Dạng này được quan sát thấy trong những phân tử chống cái chết như Bcl-2 hay Bcl-xL và những phân tử tiền chết như Bax và Bak chẳng hạn. Khả năng oligomer hoá của Bax và Bak đã được xem xét và là yếu tố quan trọng trong vai trò như là một kênh ti thể để phóng thích các yếu tố apoptosis của ti thể từ khoảng gian màng.

Mặc dù đã được nhận ra từ lâu rằng khả năng tham gia của những thành viên khác nhau thuộc họ Bcl-2 trong tương tác chọn lọc protein-protein với những thành viên khác là cần thiết cho những chức năng chống và tiền cái chết, bản chất chính xác của những tương tác này vẫn còn gây tranh cãi nhiều trong lĩnh vực apoptosis. Giả thuyết đầu tiên giải thích cơ chế hoạt động của các phân tử Bcl-2 trong apoptosis cho rằng quyết định của tế bào đi đến cái chết tuỳ thuộc vào cán cân giữa sự biểu hiện tổng cộng của họ Bcl-2 và vị trí chống apoptosis (hay tiền sống sót) đến tiền apoptosis. Giả thuyết này được chấp nhận rộng rãi vì cùng một lúc nó được ủng hộ bởi nhiều nghiên cứu (Chipuk và Green 2008). Mô hình biến trở này miêu tả ràng stoichiometry giữa các protein Bcl-2 tiền và chống apoptosis làm theo cam kết của tế bào đi đến apoptosis. Mô hình biến trở trở thành nền tảng cho sự hiểu biết về chức năng của họ protein Bcl-2 của động vật có vú và trong vài khía cạnh nó tiếp tục được thời gian kiểm chứng. Tuy nhiên, nó không giải thích được sự phức tạp mới được phát hiện gần đây trong họ bcl-2. Ví dụ, bằng cách nào tế bào chịu được những mức độ cao tương ứng của sự biểu hiện Bax và/hoặc Bak mà những protein này không gắn kết với những thành viên chống apoptosis? Bằng cách nào những protein nhất định chỉ có BH3 tham gia hoạt hoá Bax và/hoặc Bak và quá trình thấm hoá màng ngoài ti thể mà trong khi những protein không có? Những vấn đề này tiếp tục châm ngòi cho những tranh cãi và chúng là cố lõi cho những giả thuyết cạnh tranh khác về sự hoạt hoá Bax và Bak.

Một trong những mô hình này được biết đến là mô hình trung hoà protein chống apoptosis, hay mô hình “gián tiếp”. Mô hình này cho rằng những protein chống apoptosis phải liên tục ức chế hoạt động của Bax và Bak để đảm bảo cho sự sống sót và tính toàn vẹn của ti thể. Tín hiệu cho tính thấm màng ngoài ti thể là lúc tất cả các protein chống apoptosis bị trung hoà tác dụng (ví dụ rãnh gắn kết kỵ nước của protein chống apoptosis bị chiếm giữ bởi domain BH3 của protein chỉ có BH3) bởi những protein chỉ có BH3 bị hoạt hoá (dịch mã hoặc hậu dịch mã). Điều này thúc đẩy giải phóng Bx và/hoặc Bak, quá trình oligomer hoá tương đồng thành những lỗ proteolipid, và phóng thích cytochrome c. Vì khả năng hạn chế của mỗi protein chỉ có BH3 chỉ gắn kết với những protein chống apoptosis nhất định, bằng cách xác định tương đồng về cấu trúc của những peptides domain BH3 cho những protein Bcl-2 chống apoptosis, người ta giả định rằng tổ hợp các protein chỉ có BH3 nào cần để hoàn tất việc trung hoà những protein tiền apoptosis và tính thấm hoá của ti thể. Trong tất cả trường hợp, ngỵ ý rằng các protein chống apoptosis đều ức chế Bax và Bak như nhau và trung hoà một phụ nhóm các protein chống apoptosis gây ra những chất tác động mới được giải phhóng ra để nhanh chóng bị ức chế bởi bất kỳ protein chống apoptosis có sẵn nào.

image

Hình 46.19: Cơ chế apoptosis và hoạt động của ti thể (chi tiết đọc trong phần nội dung)

Mô hình trung hoà protein chống apoptosis là một bản dịch hiện đại hơn của mô hình biến trở vì nó dưa vào giả thuyết rằng protein tiền apoptosis vượt qua sự ức chế bởi những protein chống apoptosis. Mộtdđiều đáng chú ý của giả thuyết này là không phải tấ cả các phân tử tác động nội sinh đều được cô lập chủ động bởi những protein chống apoptosis. Hơn nữa, đa số cá dữ liệu về những tương tác giữa protein chỉ có BH3 và các chất chống apoptosis được dựa trên sự tổng hợp các peptides domain BH3 và sự tương tác của chúng với những protein bất động, tái tổ hợp chống apoptosis. Ngoài ra, vài bằng chứng cho tàng các protein chỉ có BH3 hiếm khi gắn kết protein tác động khi không có môi trường lipid và bề mặt gắn kết độc đáo đó được tạo ra bởi sự tương tác giữa những protein chống và tiền apoptosis. Thật ra nhiều ví dụ gợi ý rằng ái lực in vitro đo được giữa 2 protein Bcl-2 không trực tiếp chuển thành hoạt động vì cả môi trường (ví dụ tế bào chất với màng kỵ nước) và các thành phần đều ra lệnh đáp ứng tế bào.

Trong mô hình hoạt hoá trực tiếp. Sự kiện chính để tạo tính thấm của màng ngoài ti thể là tương tác giữa chấto hạt hoá trực tiếp protein chỉ có BH3 và những phân tử tác động (ví dụ Bid hoặc Bim tương tác với Bax hay Bak) tại màng ngoài ti thể. Ngăn chặn tương tác này là cần thiết cho sự toàn vẹn của ti thể và sự sống sót của tế bào vì phục hồi sau thấm hoá ti thể là không thường xảy ra. Để đảm bảo sự hoạt hoá Bax và/hoặc Bak chỉ xảy ra khi thích hợp, tế bào biểu hiện nhiều protein Bcl-2 chống apoptosis để cô lập những phân tử Bid hay Bim được hoạt hoá ngẫu nhiên. Dưới điều kiện stress tế bào và biến tính, những protein hoạt hoá trực tiếp được tạo ra để tham gia hoạt hoá Bax và/hoặc Bak. Nhưng một tế bào cố thể vượt qua tín hiệu chết bằng cách cô lập những phân tử hoạt hoá trực tiếp chỉ có BH3 vào kho các phân tử Bcl-2 chống apoptosis của nó. Mặc dù điều này mang tính tạm thời để bảo vệ tế bào, nó cho thấy tế bào có nhiệm vụ gia tăng những protein chống apoptosis để chống lại sự biểu hiện các protein chỉ có protein BH3 hoạt hoá trực tiếp đối với stress trong tương lai – thử thách này của được gọi là “sự nghiện Bcl-2” và xảy ra trong quá trình khởi phát bướu.

Đáng chú ý là sự hợp tác giữa các phân tử tác động và các protein chỉ có BH3 hoạt hoá trực tiếp đã được mô tả nhưng ái lực này dường như yếu và không dễ phát hiện ngay. Tuy nhiên sự kết hợp yếu giữa các chất hoạt hoá chỉ có BH3 và các chất tác động dẫn đến suy đoán rằng sự tương tác này không cần thiếp cho apoptosis tiếp diễn và những bước quan trọng đến thám hoá màng ngoài ti thể thật sự là tương tác giữa những protein chỉ có BH3 và các protein chống apoptosis. Tựu trung lại, có nhiều điểm cho sự cân nhắc này. Đầu tiên là mặc dù tương tác giữa những phân tử tác động và những chất hoạt hoá trực tiếp có thể yếu trong ống nghiệm vì điều kiện nó xảy ra trong tế bào không được hiểu cặn kẽ và ái lực của chúng có thể cao hơn trong cơ thể. Điều này dẫn đến câu hỏi rằng thành phần cấu trúc và tế bào nào cần thiết cho sự liên kết chất tác động và chất hoạt hoá chỉ có BH3; ví dụ, có lẽ thành phần (số ít hay số nhiều) của màng ngoài ti thể.

Rõ ràng rằng 2 mô hinh khác nhau chủ yếu ở việc Bax/Bak là hoạt động hay cần sự hoạt hoá và tương tác nào là quan trọng đối với chức năng chống apoptosis. Tuy nhiên có sự trùng lặp đáng chú ý giữa 2 mô hình này, đó là cả 2 đều gắn kết trực tiếp với Bcl-xL và ức chế protein tiền apoptosis thuuộc họ Bcl-2 liên quan trực tiếp đến sự thấm hoá màng, trong khi những protein tiền apoptosis thuộc họ Bcl-2 khác gián tiếp gây ra apoptosis bằng cách gắn kết và ngăn chặn điều này. Thêm nữa vài tác giả mặc nhận ràng cả 2 mô hình có thể đúng ở vài loại tế bào khác nhau hoặc trong một loại tế bào dưới những điều kiện khác nhau (ví dụ lành và ác).

Trên nên tảng những nghiên cứu gần đây chứng minh tầm quan trọng của những tương tác động của những thành viên họ Bcl-2 với các màng, một mô hình thứ ba gọi là “gắn với nhau” đã được đề xuất. Trong mô hình này, tươgn tác của các protein Bcl-2 với nhau thay đổi sau khi gắn kết với màng vì điều này gây ra những biến đổi hình thể làm thay đổi và/hoặc  phơi bày những bề mặt gắn kết mới. Trong mô hình này không phải các chất chống apoptosis (Bcl-xL) và tiền apoptosis (Bax) gắn với màng riêng lẻ. Tuy nhiên, điều kiện tBid tuyển lựa một trong 2 loại protein quá nhiều cho màng, điều này cho thấy là tBid hoạt hoá các protein tiền và chống apoptosis  của họ Bcl-2. Bcl-xL cạnh tranh với Bac để hoạt hoá monomer Bax hoà tan thông qua tương tác với màng, tBid hoặc Bax được tBid hoạt hoá, vì vậy ức chế việc Bax gắn với màng, sự oligomer hoá và sự thấm hoá màng. Những thí nghiệm ở đó các tương tác riêng lẻ được loại bỏ bởi đột biến cho thấy ràng cả sự gắn kết Bcl-xL-tBid và Bcl-xL-Bax đề uđóng góp vào chức năng chống apoptosis của Bcl-xL. Bằng cách cạnh tranh Bax cho những tương tác dẫn đến sự thấm hoá màng, Bcl-xL ràng buộc cả tBid và Bax vào những tương tác không hiệu quả và ức chế Bax gắn với màng. Vì Bcl-xL không oligomer hoá và tạo thành những lỗ, nó ức chế apoptosis bằng cách hoạt động như thể nó là một phiên bản tái tổ hợp âm của Bax trong tiến trình thấm hoá màng. Vì vậy, trái ngược với những mô hình khác, mô hình này cung cấp bằng chứng mạnh nhất đến giờ, sử dũng đa cơ chế để trung hoà sự hoạt hoá Bax chức năng. Gần như chắc chắn, một con đường lý thú để nghiên cứu thêm sẽ là sự phát triển của những thử nghiệm hệ thống được tổ chức lại cho phép phát hiện và theo dõi những tương tác động (hơn là tĩnh) giữa những thành viên chuyên biệt tiền và chống apoptosis của họ Bcl-2 và những protein tế bào trong màng.

Tuy nhiên, cơ chế sinh hoá chính xác dẫn đến hoạt hoá Bax và Bak vẫn còn là đeều bí ẩn và tạo nên “chén thánh” của nghiên cứu apoptosis. Bên cạnh những quan tâm từ trướccủa khoa học, tầm quan trọng của việc giải mã những cơ chế hoạt động của họ protein Bcl-2 đóng vai trò trong ứng dụng lâm sàng. Xem xét triển vọng sử dụng các thuốc BH3 minetic trong điều trị khối tân sinh, sự khác biệt có thể có kết cục sống và chết. Vì vậy, nếu apoptosis và sự sống sót tế bào dựa trên những khía cạnh mà các thành viên Bcl-2 chống apoptosis bị trung hoà thì những tế bào ung thư trở nên kháng với những thuốc như vậy hơn những phần đối kháng bình thường của chính, vì các khối bướu có xu hướng tăng biểu hiện các protein Bcl-2 chống apoptosis. Ngược lại, nếu mô hình chất hoạt hoá trực tiếp là đúng thì có thể tồn tại một cửa sổ điều trị trong đó vài khối bướu nhạy cảm với apoptosis hơn là những tế bào lành, do tăng mức độ các chất hoạt hoá trực tiếp của các tế bào bướu.

Sự thấm hoá ti thể

Các thành viên Bcl-2 tương tác ti thể hoặc trên sự tạo ra apoptosis và, mặc dù chúng có thể hoạt động trong những ngăn của tế bào, rõ ràng rằng chúng điều hoà apoptosis bằng ảnh hưởng trên màng ngoài ti thể.  Protein Bcl-2 chống apoptosis được gắn vào ER, nhân và màng ngoài ti thể vởi doman kỵ nước đầu tận C bao ngoài màng, với phần lớn các amino acid của nó trong tế bào chất. Mặc dù Bcl-2 trong bất kỳ vị trí nào cũng có thể ngăn chặn apoptosis, các chức năng của Bcl-2 tại ER và nhân không rõ ràng bằng chức năng của nó trên ti thể. Trái với Bcl-2, Bax phần lớn trong tế bào chất và cô lập neo màng kỵ nước đầu tận C vào trong túi gắn BH3 của nó, với một phần nhỏ giới hạn màng ngoài ti thể. Bax có lẽ tồn tại như một monomer trong tế bào chất. Cả thành viên chống và tiền apoptosis của họ Bcl-2 đều trải qua những thay đổi hình thể trong suốt apoptosis để lộ ra và gắn chặt vào màng lipid 2 lớp. Trong lúc cảm ứng apoptosis 2 bước trong tiến trình hoạt hoá Bax có thể được nhận biết: một sự chuyển đổi vị trí ban đầu đến ti thể và tiếp theo là biến đổi hình dáng đầu tận N có thể cùng lúc với gắn vào màng và oligomer hoá để tạo thành những kênh lớn. Bước chuyển vị trí của Bax, mặc dù có thể đảo ngược lại được trong những tình huống nhất định, thường tương quan chặt chẽ với sự cam kết bất hối của tế bào đến cái chết và đến bước phóng thích cytochrome. Bak cũng thay đồi hình dạng và oligomer hoá trong apoptosis. Mặc dù protein kênh màng ngoài ti thể VDAC2 ( kênh anion phụ thuộc điện thế-2) cũng được báo cáo là gắn với Bak và cũng quan trong cho sự nhập Bak vào màng ngoài, những con chuột được loại bỏ 3 gene Vdac1/Vdac2/Vdac3  lại có apoptosis bình thường. Điều này cho thấy có rất ít hoặc không có vai trò của VDACs trong việc điều hoà protein họ Bcl-2. Có bao nhiêu đơn vị Bax và Bak để tạo thành những oligomer này vẫn chưa rõ, tuy nhiên có vẻ như chúng được phân phối trong một lượng nhiều các phân tử.

Các cơ chế chịu trách nhiệm phóng thích các chất trung gian ti thể của cái chết tế bào vẫn còn là chủ đề bàn cãi. Có những con đường hứa hẹn, cả 2 đều dẫn đến sự thấm hoá của màng ngoài nhưng do sự hoạt hoá bởi 2 kênh khác nhau. Những kênh này là lỗ chuyển tiếp tính thấm (PTP) ở màng trong và kênh gây ra bởi apoptosis ti thể MAC ở màng.

 

Kênh apoptosis của ti thể

Phù hợp với cấu trúc chúng của chúng, cả protein tiền và chống apoptosis Bcl-2 cho thấy hoạt động tạo kênh trong ống nghiệm, mặc dù điều kiện tạo thành kênh của chúng khác nhau. Cụ thể là oligomer Bax tạo những kênh cation chọn lọc không phụ thuộc điện thế khi được tạo lại trong các liposome, với độ dẫn từ vài pS đến nhiều nS. Đường kính ước tính cho những kênh Bax (từ độ dẫn cao nhất 1-5.4 nS) là 2.7-5.4 nm. Con số này cho thấy, nhiều kênh Bax có thể dễ dàng cho phép cytochrome c (kích thước gần 3nm) đi qua. Lưu ý, các kênh Bax cũng như sự phóng thích nhiều hợp chất từ liposomes chứa kênh Bax có thể bị chận bởi những protein chống apoptosis Bcl-2 và Bcl-xL.

Kênh do apoptosis gây ra MAC được phát hiện đầu tiên trong thí nghiệm patch-clamp trên ti thể phân lập từ các tế bào FL5.12 12 giờ sau khi lấy đi yếu tố tăng trường interleukin-3  (IL-3) và từ đó được nghiên cứu trong nhiều hệ thống. MAC là một kênh không đồng nhất độ dẫn cao. Độ dẫn trung bình của MAC của các tế bào HeLa apoptosis và FL5.12 là 3.3 và 4.5 nS tương ứng. Điều này còn cho thấy các mức độ đa phụ dẫn. Đường kính lỗ được tính với phương pháp loại trừ polymer cho thấy những kênh với độ dẫn khoảng 1.5 – 5nS có kích thước lỗ trong khoảng 3.3-6nm. Vì vậy, hoạt động MAC giống đáng kể với với hoạt động của Bax tái tổ hợp, nhưng khác với những kênh lớn được mô tả khác, như kênh TOM và TIM được tìm thấy trên cả 2 màng ti thể. Quan trong là MAC chỉ được mô tả sớm trong apoptosis cùng lúc với sự phóng thích cytochrome c. Kênh khổng lồ màng ngoài này được điều hoà một cách tinh tế bởi những protein họ Bcl-2. Sự biểu hiện quá mức Bcl-2 chặn sự thành lập MAC và phóng thích cytochrome c. Nhiều tiếp cận thực nghiệm cho rằng cà Bax và Bak là những thành phần giả định của kênh này. Có thể là kích thước trung bình của lỗ MAC tăng lên với tiến triển apoptosis bởi sự bất hợp tác của những phân tử Bax và/hoặc Bak thêm vào trong phức hợp kênh MAC, hoặc có thể bằng những cấu thành khác chưa nhận dạng. Thêm vào đó, mối quan hệ giữa MAC và các protein đa domain tiền apoptosis Bax và Bak cũng được kiểm tra bằng những tiếp cận phân tử. Những nghiên cứu trước đây sử dụng những dòng tế bào kncok out đơn và kép cho Bax và Bak cho thấy rằng 2 protein này có rất nhiều đối với vai trò của chúng trong apoptosis. Đó là sự phóng thích cytochorme xảy ra trong những tế bào loại bỏ đơn Bax và Bak mà không phải trong những tế bào loại bỏ kép Bax/Bak trong quá trình điều trị staurosporine. Tương tự như vậy, MAC được phát hiện trong các dòng tế bào loại bỏ đơn, không phải tế bào loại bỏ kép trong apoptosis. Những dữ kiện này cho thấy ràng Bak có thể thay thế Bax như một thành phần cấur túc của MAC trong những tế bào thiếu Bax. Vì vậy Bax và Bak có chức năng dư thừa đối với MAC. Trong tình huống này, MAC thành lập trong màng ngàoi ti thể ở giai đoạn sớm của apoptosis và cung cấp trực tuếp lộ trình cho sự phóng thích cytochrome c từ khảong gian màng cho tế bào chất, làm hoạt hoá các caspases đao phủ và chết tế bào. Vì vậy, người ta giả thuyết rằng MAC là con dao cắt cytochrome c từ ti thể.

Sự chuyển đổi tính thấm của ti thể

Sự chuyển đổi tính thấm ti thể được mô tả đầu tiên cách đây hơn 25 năm với sự tăng đột ngột tính thấm của màng trong ti thể để hoà tan các phân tử có trọng lượng lên đến 1.5kDa. Cấu trúc của ti thể để sự chuyển đổi tính thấm được cho là màng trong ti thể, tại các lỗ chuyển đổi tính thấm (PTP). Điều đáng nói ở đây là mặc cho thời gian dài trôi qua từ khi loài người phám phá ra nó, bản chất chính xác của lỗ tạo thành các thành phần PTP vẫn chưa được biết rõ. Tuy nhiên, có vài chứng cứ về sự hiện diện của các protein tại đây. Thêm vào đó, người ta cho là PTP tạo nên những vị trí tiếp xúc (ví dụ như những vị trí mà màng trong và ngoài của ti thể gần nhau). Theo các mô hình kinh điển, kênh phụ thuộc điện thế chọn lọc anion hay VDAC, adenine cnucleotide tranlocator (ANT) và cycloophilin D với những chất khác có liên hệ với PTP. Và người ta cũng biết, PTP có thể được hoạt hoá bởi vô số các chất tác động bao gồm Ca2+, phosphate và ROS. PTP thường có thể được đóng lại thuận nghịch bởi sự giảm nồng độ Ca2+ với EGTA hay bởi sự tăng nồng độ cyclosporine A, magnesium hay ADP.

Tại thời điểm này, vai trò của PTP trong apoptosis gây khá nhiều tranh cãi. Thật vậy, vài nghiên cứu cho rằng PTP đóng vai trò là thành phần khởi phát lộ trình ti thể. Với quan điểm này này, những chất gây chuyển đổi tính thấm trong ti thể được phân lập thường gây apoptosis và PTP bất hoạt hay trì hoãn bởi thuốc chống apoptosis như cyclosporine A chẳng hạn. Tương tự, PTP đè nén hoạt hoá Ca2+ bằng cách biểu hiện quá mức Bcl-2, hỗ trợ vai trò cho kênh này trong apoptosis.

Cyclophilin-D là một chất điều hoà PTP. Những tế bào thiếu cyclophilin-D một cách đáng kể sẽ chết tự nhiên để đáp ứng lại với kích thích apoptosis gây hoạt hoá cả lộ trình nội sinh và ngoại sinh. Hơn nữa, sự phóng thích cytochrome c có thể xảy ra khi không có khử cực ti thể và  khi mất tính toàn vẹn của màng ngoài. Những quan sát này cho thấy, thay vì gây vỡ ti thể, một cơ chế thấm hoá chọn lọc hơn được điều hành cũng như sự thành lập một lỗ hổng trong màng ngoài.

Tuy nhiên, thật sai lầm nếu cho rằng PTP không liên quan gì đến apoptosis. Việc mở PTP, mặc dù theo sau MAC, vẫn có thể dẫn đến sự phóng thích hoàn toàn cytochrome c và những yếu tố tiền apoptosis khác từ mào ti thể, điều này sẽ hiệp đồng khuếch đại dòng thác apoptosis do MAC khởi phát. Hơn nữa, sự trì hoãn tiến triển của quá trình apoptosis gây ra bởi các chất ức chế PTP như cyclosporine A có thể liên quan đến khả năng trì hoãn khử cực và tạo năng lượng cũng như bất kỳ tác động hiệp đồng của nhiều cytochrome c hơn được phóng thích sau đó từ mào ti thể.

Tu sửa mào ti thể

Bên cạnh chất nền và khoảng gian màng của ti thể, những nghiên cứu hình thái học với kính hiển vi chụp cắt lớp điện tử đã cho thấy khoảng nội mào ti thể liên lạc với khoảng gian màng thông qua những chỗ nối gống như nút chai rất chặt, vì vậy chúng tạo thành rào cản khuếch tán. Hầu hết cytochrome c (85%) được chứa trong cấu trúc này. Tu sửa mào là một tiến trình mà trong đó những chỗ nối phân định khoảng nội mào lớn lên. Điều này tạo thuận lợi cho quá trình huy động cytochrome c đến khoảng gian màng.

Nhiều protein liên quan đến động học ti thể (sự hợp nhất và phân rã) có thể đóng vai trò chính trong việc tái tổ chức tiền apoptosis của mào. Ví dụ, Drp1 (protein liên quan đến dynamin 1) tham gia vào quá trình tan rã ti thể và cần thiết cho sự phóng thích tối ưu cytochrome c. Ngược lại, việc ức chế quá trình hợp nhất ti thể do mất một thành viên khác của họ dynamin ti thể – Opa1 (optic atrophia 1) sẽ gây ra apoptosis tự động. Hơn nữa, các nghiên cứu gần đây cho thấy Opa1 điều khiển sự thành lập mào ti thể và những chỗ nối chặt ở mào có thể ức chế cytochrome trong quá trình apoptosis.

Kết luận

Apoptosis là một trận chiến các tế bào chống lại chính sự sống của chúng. Như vậy chiến trường là chính tế bào. Nỗ lực của trận chiến đặc biệt này là để hy sinh một/một số cá thể để đa số được tồn tại. Vì lý do này, không thể xem apoptosis là một trận chiến mà tế bào luôn thua. Trái lại, những sinh vật có mức tiến hóa cao vẫn không thoát khỏi apoptosis và rõ ràng là chúng ta nên ước rằng tiến trình này cứ tiếp tục xảy ra trong mỗi chúng ta, đến khi chúng ta bị đánh bại bởi một trận chiến cuối cùng không thể thương lượng được.

Cuối cùng, chắc hẳn chúng đa đã nhận ra rằng sự hiểu biết chi tiết các hoạt động của những con đường dẫn đến chết tế bào là cách tốt nhất để thiết kế nhiều chiến lược bảo vệ lại những tác nhân gây bệnh nội bào, biến đổi tế bào và để có thể hiểu bằng cách nào virus và các khối u tránh khỏi sự phá huỷ miễn dịch. Chắc chắn là nghiên cứu trong lĩnh vực này cũng sẽ giúp chúng ta hiểu những cơ chế quan trong trong chuyển hoá tế bào bình thường.

Advertisements

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s